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摘要：醛酮还原酶是一类依赖NAD（P）H的氧化还原酶，在生物体内参与了糖代谢、酮代谢和物质运输等多种生理过程。为了解黄鳝醛酮还原酶在细胞逆境胁迫中的保护作用，采用液体培养和斑点展示法，比较含黄鳝醛酮还原酶Eakr的重组菌株和阴性对照菌株在NaCl、Cu2 和H2O2等非生物胁迫下的存活率和生长活力。结果表明，含重组醛酮还原酶Eakr的大肠杆菌在高渗透压、重金属和氧化胁迫下的生存率显著高于阴性对照，其生存活力也大大增强。提示黄鳝醛酮还原酶Eakr可能参与了细胞活性氧代谢和物质运输等多种生理过程。
关键词：醛酮还原酶;非生物胁迫;存活率;耐受性
中图分类号： S188 .3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0159-03
醛酮还原酶（aldo keto reductase，AKR）是一类通过与辅酶NAD（P）H结合将醛酮类物质还原为相应醇类的的氧化还原酶。它包括16 个家族，近200个成员，在酵母、植物、哺乳动物以及原核生物中均有报道 [1]。醛酮还原酶既参与了人类细胞对外源、内源性毒性物质的代谢过程，也导致了某些重要疾病的发生与发展[2]。人类醛酮还原酶AKR7A家族的成员不仅能够抵抗活性醛类物质氧化毒害的作用[3]，而且还参与了活性氧代谢，是机体重要的防御酶[4-5];相反，胰脏肿瘤细胞中AKR1B10基因被抑制后可有效抑制肿瘤细胞癌变，提示AKR1B10可能参与了肿瘤形成的过程[6]。除此以外，AKRs还可以催化视黄醛还原成视黄醇，影响生物体视觉的形成[7]，并且在维持膜电位、细胞内外渗透压平衡以及物质跨膜运输等方面扮演重要的角色[8]。植物和微生物中发现的醛酮还原酶似乎还是机体抵抗干旱、盐胁迫和重金属等非生物胁迫的重要因子[9-10]。目前，国内外对于鱼类醛酮还原酶功能的研究相对贫乏。代海艳等初步探讨了黄鳝醛酮还原酶的羰基解毒作用，发现该酶可有效降低丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物的毒害作用[11]。但对其是否参与了细胞重金属代谢、盐离子胁迫和活性氧代谢等过程尚不甚清楚。本研究拟通过对比含黄鳝醛酮还原酶Eakr菌株和空白质粒菌株，在高渗透压、重金属和氧化3种逆境胁迫处理下的存活率及生长活力差异，分析黄鳝醛酮还原酶在细胞非生物胁迫中的保护作用，为深入了解黄鳝醛酮还原酶的生物学功能提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 试验菌株与试剂
供试菌株含pET-28a-Eakr重组质粒BL21菌株和 pET-28a空质粒BL21菌株，均由长江大学生物医药研究所保存。抗生素、CuSO4、NaCl和H2O2等均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白的诱导表达检测 该试验于2016—2017年在长江大学生物医药研究所动物基因组研究室完成，将实验室保存的pET-28a-Eakr重组质粒阳性克隆菌株在LB平板（含50 g/mL Kana）上划线，37 ℃过夜培养。在平板上挑取单菌落于LB液体培养基（含50 g/mL Kana）中，37 ℃ 200 r/min振荡培养。待培养D600 nm值至约0.6时，加入终浓度为 0.1 mmol/L 的IPTG，37 ℃诱导培养4 h。使用12%的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白是否表达。
1.2.2 不同胁迫因子处理及存活率、生长活力展示 首先，用LB培养基将pET-28a-Eakr重组质粒菌株培养至D600 nm至约为0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导培养 4 h。取6个EP管，各加入1 mL诱导后菌液，同时加入NaCl，使NaCl终浓度分别为0、50、100、150、200、250 mmol/L，37 ℃ 150 r/min培养1 h。离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体后，使用1 mL新鲜LB重悬。取10 μL菌液进行101、102、103、104、105、106……倍梯度稀释。取50 μL稀释后的菌液，均匀涂在LB平板（含50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培养箱中恒温培养 12 h。选择菌落数目在500 以内的平板，用菌落分析仪进行计数。根据稀释倍数，计算不同浓度NaCl处理后大肠杆菌的存活个数。存活率Sr=（非生物胁迫后菌落总数/空白对照菌落总数）×100%。
斑点展示法表征菌落生长活力：将不同胁迫条件处理后的菌液进行1倍、10倍、100倍、1 000倍稀释，取5 μL点在LB平板（含 50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養箱中培养，12 h后将平板放入菌落分析仪中拍照并保存。将含pET-28a空质粒菌株（WT）做以上相同处理，每个处理重复3次。
同样采用类似方法进行CuSO4、H2O2的液体培养和斑点形成展示。CuSO4胁迫处理终浓度为0、2、4、6、8、10 mmol/L，H2O2胁迫处理终浓度为0、1、2、4、8、16 mmol/L。
1.2.3 数据处理与分析 采用SPSS 20.0 进行数据处理和统计学分析，存活率均用“ x±s”表示，P
关键词：醛酮还原酶;非生物胁迫;存活率;耐受性
中图分类号： S188 .3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0159-03
醛酮还原酶（aldo keto reductase，AKR）是一类通过与辅酶NAD（P）H结合将醛酮类物质还原为相应醇类的的氧化还原酶。它包括16 个家族，近200个成员，在酵母、植物、哺乳动物以及原核生物中均有报道 [1]。醛酮还原酶既参与了人类细胞对外源、内源性毒性物质的代谢过程，也导致了某些重要疾病的发生与发展[2]。人类醛酮还原酶AKR7A家族的成员不仅能够抵抗活性醛类物质氧化毒害的作用[3]，而且还参与了活性氧代谢，是机体重要的防御酶[4-5];相反，胰脏肿瘤细胞中AKR1B10基因被抑制后可有效抑制肿瘤细胞癌变，提示AKR1B10可能参与了肿瘤形成的过程[6]。除此以外，AKRs还可以催化视黄醛还原成视黄醇，影响生物体视觉的形成[7]，并且在维持膜电位、细胞内外渗透压平衡以及物质跨膜运输等方面扮演重要的角色[8]。植物和微生物中发现的醛酮还原酶似乎还是机体抵抗干旱、盐胁迫和重金属等非生物胁迫的重要因子[9-10]。目前，国内外对于鱼类醛酮还原酶功能的研究相对贫乏。代海艳等初步探讨了黄鳝醛酮还原酶的羰基解毒作用，发现该酶可有效降低丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物的毒害作用[11]。但对其是否参与了细胞重金属代谢、盐离子胁迫和活性氧代谢等过程尚不甚清楚。本研究拟通过对比含黄鳝醛酮还原酶Eakr菌株和空白质粒菌株，在高渗透压、重金属和氧化3种逆境胁迫处理下的存活率及生长活力差异，分析黄鳝醛酮还原酶在细胞非生物胁迫中的保护作用，为深入了解黄鳝醛酮还原酶的生物学功能提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 试验菌株与试剂
供试菌株含pET-28a-Eakr重组质粒BL21菌株和 pET-28a空质粒BL21菌株，均由长江大学生物医药研究所保存。抗生素、CuSO4、NaCl和H2O2等均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白的诱导表达检测 该试验于2016—2017年在长江大学生物医药研究所动物基因组研究室完成，将实验室保存的pET-28a-Eakr重组质粒阳性克隆菌株在LB平板（含50 g/mL Kana）上划线，37 ℃过夜培养。在平板上挑取单菌落于LB液体培养基（含50 g/mL Kana）中，37 ℃ 200 r/min振荡培养。待培养D600 nm值至约0.6时，加入终浓度为 0.1 mmol/L 的IPTG，37 ℃诱导培养4 h。使用12%的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白是否表达。
1.2.2 不同胁迫因子处理及存活率、生长活力展示 首先，用LB培养基将pET-28a-Eakr重组质粒菌株培养至D600 nm至约为0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导培养 4 h。取6个EP管，各加入1 mL诱导后菌液，同时加入NaCl，使NaCl终浓度分别为0、50、100、150、200、250 mmol/L，37 ℃ 150 r/min培养1 h。离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体后，使用1 mL新鲜LB重悬。取10 μL菌液进行101、102、103、104、105、106……倍梯度稀释。取50 μL稀释后的菌液，均匀涂在LB平板（含50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培养箱中恒温培养 12 h。选择菌落数目在500 以内的平板，用菌落分析仪进行计数。根据稀释倍数，计算不同浓度NaCl处理后大肠杆菌的存活个数。存活率Sr=（非生物胁迫后菌落总数/空白对照菌落总数）×100%。
斑点展示法表征菌落生长活力：将不同胁迫条件处理后的菌液进行1倍、10倍、100倍、1 000倍稀释，取5 μL点在LB平板（含 50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養箱中培养，12 h后将平板放入菌落分析仪中拍照并保存。将含pET-28a空质粒菌株（WT）做以上相同处理，每个处理重复3次。
同样采用类似方法进行CuSO4、H2O2的液体培养和斑点形成展示。CuSO4胁迫处理终浓度为0、2、4、6、8、10 mmol/L，H2O2胁迫处理终浓度为0、1、2、4、8、16 mmol/L。
1.2.3 数据处理与分析 采用SPSS 20.0 进行数据处理和统计学分析，存活率均用“ x±s”表示，P