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[摘要]目的 探讨苦参碱对结肠癌耐药细胞化疗药物敏感性及自噬水平的影响。方法 分别采用浓度为0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦参碱作用于结肠癌细胞HCT-8/VCR，分别在24 h、48 h，采用CCK-8法检测苦参碱对结肠癌细胞HCT-8及其耐药细胞HCT-8/VCR的抑制作用，并计算出抑制率：运用Western Blotting检测自噬相关基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表达。采用流式细胞术检测苦参碱作用耐药细胞后的细胞凋亡率。结果在苦参碱作用24 h和48 h后，HCT-8细胞增殖的抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强，苦参碱对HCT-8细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.001）。对各组细胞的凋亡率检测发现，采用苦参碱的实验组的细胞凋亡率大大高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。在苦参碱应用24 h后，HCT-8/VCR细胞质中出现了自噬泡。Western Blotting检测显示随着苦参碱浓度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平也随之增强。结论苦参碱能够提高结肠癌耐药细胞的自噬水平，逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的多药耐药性，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。
[关键词]苦参碱；结肠癌；耐药细胞化疗药物敏感型；自噬水平
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率一直居高不下。结肠癌患者死亡率高的主要原因是化疗过程中细胞对药物的耐药性。结肠癌细胞的细胞膜、细胞质、细胞核等作用及结构发生变化，导致化疗药物的敏感性降低，从而产生耐药性。常见的耐药途径如抗凋亡、药物靶点或代谢酶改变、自噬及结肠癌细胞过度增殖等都是化疗药物产生抗药性的主要机制。许多学者对多药耐药性的抑制剂进行了长久的探索，近年来中医药抗肿瘤作用的研究备受关注，尤其在逆转化疗耐药方面。苦参碱是由豆科植物类提取的生物碱，具有抗肿瘤、抗肝纤维化、治疗病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在结肠癌自噬方面研究相对较少。本研究观察苦参碱对结肠癌耐药细胞的化疗药物敏感性及自噬水平的影响，旨在为临床应用苦参碱干预肿瘤机理提供依据。
1.资料与方法
1.1实验仪器 超净工作台、CO2恒温培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、滤器、真空泵、显微镜、天平、高速低温离心机、恒温水浴锅、匀浆器、电泳仪、电泳槽、微波炉、平底烧瓶、凝胶成像仪等仪器。
1.2实验方法
1.2.1CCK-8法检测 取对数生长期的HCT-8/VCR、HCT-8细胞，按细胞传代方法制备细胞悬液，并进行细胞计数，将2组细胞接种于96孔板，实验组加入化疗药长春新碱及5-FU、阿霉素（ADM），空白对照及阴性组加等体积培养液。培养一段时问后观察细胞株的耐药情况。
1.2.2CCK-8法检测苦参碱干预后HCT-8/VCR细胞药敏性的变化 根据耐药细胞株HCT-8/VCR的多药耐药性的实验结果.制备HCT-8/VCR+Ma细胞。各取1瓶处于对数生长期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma细胞，每组分为实验组、阴性对照组及空白对照组。以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制浓度效应曲线.求回归方程.得出50%抑制浓度（IC50）。计算逆转倍数：逆转倍数=耐药细胞IC50/Ma作用后耐药细胞IC50。
1.2.3流式细胞术检测苦参碱作用耐药细胞后的细胞凋亡率 取对数生长期的HCT-8/VCR及HCT-8细胞，将2组细胞接种于6孔板，每组细胞分别设2个组：对照组、实验组，实验组中加入上述适宜浓度的Ma，对照组不经任何处理。继续培养48 h后，实验组加人不同浓度的化疗药长春新碱.对照组中的耐药组加入同浓度、等量长春新碱，对照组的亲本细胞组不做任何处理作为阴性对照。继续培养4 h，取出细胞用FCM法检测细胞凋亡率。
1.2.4Western Blotting检测自噬相关基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表达 取处于生长期的HCT-8/VCR，分到2个培养瓶培养48 h，1瓶为实验组，加人无毒性浓度的Ma.1瓶为阴性对照组.加人等量培养基，继续培养48 h。用RIPI细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白质样品，用BCA法测定蛋白质浓度。之后对两组细胞进行转膜、SDS-PAGE电泳、封闭与杂交，最后曝光鉴定自噬相关基因的表达。
1.2.5MDC法检测单用长春新碱或苦参碱或者两者联合应用后自噬囊泡的形成 按照实验分组进行细胞培养，干预48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃温育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.弃甲醛晾干后.荧光显微镜下观察细胞自噬囊泡的形成情况，计数，拍照。
1.3评价指标 （1）在全自动酶标仪上于490 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值，计算5个复孔平均OD值.计算Ma作用48 h后对HCT-8/VCR、HCT-8细胞的抑制率（inhibition rate，IR）。计算公式：IR（%）=[1-（实验组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%。不同浓度的抑制率分别为5个复孔细胞抑制率的平均值；（2）对照组和实验组的细胞凋亡率分别为6个孔细胞凋亡率的平均值。
1.4统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，数据以均数±标准差表示，两组方差齐性采用t检验，两组方差不齐采用t’检验。多组均数间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较采用q检验（Newman-Keuls法），检验水准：a=0.05，双侧检验。
2.结果
2.1苦参碱的不同浓度对HCT-8/VCR细胞增殖的抑制率 在苦参碱作用24 h和48 h后，苦参碱对HCT-8细胞增殖有抑制作用且其抑制作用会随着苦参碱浓度的增加而增强。与浓度为0.5 mg/ml相比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表1。 2.2FCM检测苦参碱作用后两组细胞HCT-8/VCR的凋亡率比较 运用FCM方法对各组细胞的凋亡率进行检测发现.采用苦参碱的实验组的细胞凋亡率大大高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），说明苦参碱可以诱导细胞的凋亡。见表2。
2.3Western Blotting检测结果 在苦参碱应用24 h后，HCT-8/VCR细胞质中出现了带有细胞器的泡状结构，经确认为自噬泡。Western Blotting检测显示随着苦参碱浓度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平也随之增强。
3.讨论
近年来有关中医药治疗肝癌的研究取得较大进展，成为临床实验研究热点之一，中药因其低毒、高效与多阶段性作用的优势，已在肿瘤化疗耐药逆转方法的研究中逐步受到重视。苦参碱（Matrine）是一种从我国传统中药苦参、广豆根中提取的生物碱。前期研究表明苦参碱对结肠癌患者的恢复有促进作用.它可以使hTERT表达下调.抑制结肠癌细胞增殖和端粒酶活性，诱导细胞凋亡。本研究运用苦参碱对结肠癌细胞HCT-8/VCR进行研究，结果发现，苦参碱具有抗肿瘤的药理活性，能抑制肿瘤细胞转移、增殖、诱导其凋亡及向正常细胞分化。苦参碱作用24 h和48 h，HCT-8细胞增殖的抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强.对HCT-8细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。运用FCM方法对各组细胞的凋亡率进行检测发现，采用苦参碱的实验组的细胞凋亡率大大高于对照组，说明苦参碱可以诱导细胞的凋亡，抑制结肠癌细胞增殖。在苦参碱应用24 h后，HCT-8/VCR细胞质中出现了带有细胞器的泡状结构，经确认为自噬泡。苦参碱是一类独特的生物碱，具有抗肝纤维化、抗肿瘤、治疗病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年来其抗肿瘤作用的研究备受关注，尤其在逆转化疗耐药方面。自噬在结直肠癌的发生发展过程中起到了重要作用。自噬可以使结肠癌细胞的适应凋亡刺激、耐受侵袭性以及营养缺乏的能力提高，在某种程度下会引起结肠癌的发生。有研究证实：在早期和进展期结肠癌中关键蛋白LC3和Beclin-1表达升高，使结直肠癌核心部位细胞可以耐受营养缺乏和缺氧。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的主要途径，是促进患者化疗成功的重要因素。在大多数情况下，自噬与结肠癌细胞耐药性密切相关，抑制自噬就可以增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性，提高患者的化疗效果。以往实验结果表明在LC3细胞形态学、染色等方面苦参碱能够诱导结肠癌细胞发生自噬。我们用Western Blotting检測发现随着苦参碱浓度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平也随之增强，与上述文献结果相一致。本研究对苦参碱在结肠癌自噬方面也进行了分析，为临床应用苦参碱干预肿瘤机理提供依据，但此次研究仍存在样本例数较少等诸多不足，有必要扩大样本例数进一步观察。
综上所述，苦参碱能够提高结肠癌耐药细胞的自噬水平，逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的多药耐药性，诱导细胞的凋亡，抑制细胞的增殖，为临床应用苦参碱抗肿瘤提供理论依据。
[关键词]苦参碱；结肠癌；耐药细胞化疗药物敏感型；自噬水平
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率一直居高不下。结肠癌患者死亡率高的主要原因是化疗过程中细胞对药物的耐药性。结肠癌细胞的细胞膜、细胞质、细胞核等作用及结构发生变化，导致化疗药物的敏感性降低，从而产生耐药性。常见的耐药途径如抗凋亡、药物靶点或代谢酶改变、自噬及结肠癌细胞过度增殖等都是化疗药物产生抗药性的主要机制。许多学者对多药耐药性的抑制剂进行了长久的探索，近年来中医药抗肿瘤作用的研究备受关注，尤其在逆转化疗耐药方面。苦参碱是由豆科植物类提取的生物碱，具有抗肿瘤、抗肝纤维化、治疗病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在结肠癌自噬方面研究相对较少。本研究观察苦参碱对结肠癌耐药细胞的化疗药物敏感性及自噬水平的影响，旨在为临床应用苦参碱干预肿瘤机理提供依据。
1.资料与方法
1.1实验仪器 超净工作台、CO2恒温培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、滤器、真空泵、显微镜、天平、高速低温离心机、恒温水浴锅、匀浆器、电泳仪、电泳槽、微波炉、平底烧瓶、凝胶成像仪等仪器。
1.2实验方法
1.2.1CCK-8法检测 取对数生长期的HCT-8/VCR、HCT-8细胞，按细胞传代方法制备细胞悬液，并进行细胞计数，将2组细胞接种于96孔板，实验组加入化疗药长春新碱及5-FU、阿霉素（ADM），空白对照及阴性组加等体积培养液。培养一段时问后观察细胞株的耐药情况。
1.2.2CCK-8法检测苦参碱干预后HCT-8/VCR细胞药敏性的变化 根据耐药细胞株HCT-8/VCR的多药耐药性的实验结果.制备HCT-8/VCR+Ma细胞。各取1瓶处于对数生长期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma细胞，每组分为实验组、阴性对照组及空白对照组。以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制浓度效应曲线.求回归方程.得出50%抑制浓度（IC50）。计算逆转倍数：逆转倍数=耐药细胞IC50/Ma作用后耐药细胞IC50。
1.2.3流式细胞术检测苦参碱作用耐药细胞后的细胞凋亡率 取对数生长期的HCT-8/VCR及HCT-8细胞，将2组细胞接种于6孔板，每组细胞分别设2个组：对照组、实验组，实验组中加入上述适宜浓度的Ma，对照组不经任何处理。继续培养48 h后，实验组加人不同浓度的化疗药长春新碱.对照组中的耐药组加入同浓度、等量长春新碱，对照组的亲本细胞组不做任何处理作为阴性对照。继续培养4 h，取出细胞用FCM法检测细胞凋亡率。
1.2.4Western Blotting检测自噬相关基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表达 取处于生长期的HCT-8/VCR，分到2个培养瓶培养48 h，1瓶为实验组，加人无毒性浓度的Ma.1瓶为阴性对照组.加人等量培养基，继续培养48 h。用RIPI细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白质样品，用BCA法测定蛋白质浓度。之后对两组细胞进行转膜、SDS-PAGE电泳、封闭与杂交，最后曝光鉴定自噬相关基因的表达。
1.2.5MDC法检测单用长春新碱或苦参碱或者两者联合应用后自噬囊泡的形成 按照实验分组进行细胞培养，干预48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃温育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.弃甲醛晾干后.荧光显微镜下观察细胞自噬囊泡的形成情况，计数，拍照。
1.3评价指标 （1）在全自动酶标仪上于490 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值，计算5个复孔平均OD值.计算Ma作用48 h后对HCT-8/VCR、HCT-8细胞的抑制率（inhibition rate，IR）。计算公式：IR（%）=[1-（实验组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%。不同浓度的抑制率分别为5个复孔细胞抑制率的平均值；（2）对照组和实验组的细胞凋亡率分别为6个孔细胞凋亡率的平均值。
1.4统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，数据以均数±标准差表示，两组方差齐性采用t检验，两组方差不齐采用t’检验。多组均数间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较采用q检验（Newman-Keuls法），检验水准：a=0.05，双侧检验。
2.结果
2.1苦参碱的不同浓度对HCT-8/VCR细胞增殖的抑制率 在苦参碱作用24 h和48 h后，苦参碱对HCT-8细胞增殖有抑制作用且其抑制作用会随着苦参碱浓度的增加而增强。与浓度为0.5 mg/ml相比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表1。 2.2FCM检测苦参碱作用后两组细胞HCT-8/VCR的凋亡率比较 运用FCM方法对各组细胞的凋亡率进行检测发现.采用苦参碱的实验组的细胞凋亡率大大高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），说明苦参碱可以诱导细胞的凋亡。见表2。
2.3Western Blotting检测结果 在苦参碱应用24 h后，HCT-8/VCR细胞质中出现了带有细胞器的泡状结构，经确认为自噬泡。Western Blotting检测显示随着苦参碱浓度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平也随之增强。
3.讨论
近年来有关中医药治疗肝癌的研究取得较大进展，成为临床实验研究热点之一，中药因其低毒、高效与多阶段性作用的优势，已在肿瘤化疗耐药逆转方法的研究中逐步受到重视。苦参碱（Matrine）是一种从我国传统中药苦参、广豆根中提取的生物碱。前期研究表明苦参碱对结肠癌患者的恢复有促进作用.它可以使hTERT表达下调.抑制结肠癌细胞增殖和端粒酶活性，诱导细胞凋亡。本研究运用苦参碱对结肠癌细胞HCT-8/VCR进行研究，结果发现，苦参碱具有抗肿瘤的药理活性，能抑制肿瘤细胞转移、增殖、诱导其凋亡及向正常细胞分化。苦参碱作用24 h和48 h，HCT-8细胞增殖的抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强.对HCT-8细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。运用FCM方法对各组细胞的凋亡率进行检测发现，采用苦参碱的实验组的细胞凋亡率大大高于对照组，说明苦参碱可以诱导细胞的凋亡，抑制结肠癌细胞增殖。在苦参碱应用24 h后，HCT-8/VCR细胞质中出现了带有细胞器的泡状结构，经确认为自噬泡。苦参碱是一类独特的生物碱，具有抗肝纤维化、抗肿瘤、治疗病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年来其抗肿瘤作用的研究备受关注，尤其在逆转化疗耐药方面。自噬在结直肠癌的发生发展过程中起到了重要作用。自噬可以使结肠癌细胞的适应凋亡刺激、耐受侵袭性以及营养缺乏的能力提高，在某种程度下会引起结肠癌的发生。有研究证实：在早期和进展期结肠癌中关键蛋白LC3和Beclin-1表达升高，使结直肠癌核心部位细胞可以耐受营养缺乏和缺氧。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的主要途径，是促进患者化疗成功的重要因素。在大多数情况下，自噬与结肠癌细胞耐药性密切相关，抑制自噬就可以增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性，提高患者的化疗效果。以往实验结果表明在LC3细胞形态学、染色等方面苦参碱能够诱导结肠癌细胞发生自噬。我们用Western Blotting检測发现随着苦参碱浓度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平也随之增强，与上述文献结果相一致。本研究对苦参碱在结肠癌自噬方面也进行了分析，为临床应用苦参碱干预肿瘤机理提供依据，但此次研究仍存在样本例数较少等诸多不足，有必要扩大样本例数进一步观察。
综上所述，苦参碱能够提高结肠癌耐药细胞的自噬水平，逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的多药耐药性，诱导细胞的凋亡，抑制细胞的增殖，为临床应用苦参碱抗肿瘤提供理论依据。