目的 对两例无明确新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19,以下简称新冠肺炎）流行病学史，经多次核酸检测确诊的新冠肺炎病例实验室确诊过程进行总结分析，为新冠病毒核酸检测提供经验。方法 收集北京市2020年1-2月两例无明确新冠肺炎流行病史，且经多次核酸检测确诊的新冠肺炎病例的流行病学、临床表现等资料和实验室检测结果进行回顾性分析。结果 病例A,2020年1月19日发热伴全身疼痛、头痛，先后就诊2家医院，发热和肺炎病情未缓解。发病前有京外旅行史，2020年1月22日患者收入A2医院隔离治疗，诊断为“肺炎待查”并上报为新冠肺炎疑似病例。当日采集样本送北京市疾病预防控制中心（CDC）实验室进行荧光RT-PCR检测，N基因阳性。按当时《新型冠状病毒肺炎防控方案（第二版）》规定，实验室要求继续采样。1月23日再次采集样本，荧光RT-PCR检测ORF1ab和N基因阳性，该病例为新冠肺炎确诊病例。病例B,2020年2月3日发热，先后就诊3家医院，发热伴全身疼痛、头晕头痛。患者于2月9日在B3医院发热门诊就诊，并单间隔离治疗，上报为新冠肺炎疑似病例。2月10日和11日分别采集样本送北京市CDC实验室进行荧光PCR检测，ORF1ab和N基因阴性，但2月10日样本的N基因在反应后期显示出荧光值小于判定阈值线的微弱信号。2月12日再次采集样本检测，ORF1ab和N基因阳性，该病例为新冠肺炎确诊病例。结论 因新冠肺炎临床表现无特异性，实验室病原学的核酸检测非常重要；如果新冠肺炎疑似病例首次样本检测结果阴性或可疑，建议再次采集多种类样本进行检测，以便尽可能早诊断。