论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨FEZ1基因在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义。方法：收集宫颈鳞癌标本102例，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）66例，正常宫颈组织40例。通过免疫组织化学（immuno-histochemistry，IHC）方法检测各标本中FEZ1蛋白的表达情况，并分析其表达与宫颈鳞癌临床参数的关系。结果：FEZ1蛋白在正常宫颈组织中的阳性表达率显著高于CIN和宫颈鳞癌组织（P<0.05）；FEZ1蛋白的表达随着癌组织分化程度的降低而显著降低（P<0.05），而与患者年龄、浸润深度、临床分期和有无淋巴结转移无关（P>0.05）。结论：FEZ1的表达缺失或下调可能与宫颈鳞癌的发生与演进有关。
【关键词】 FEZ1； 宫颈鳞癌； 免疫组织化学
宫颈癌是女性生殖系统第二大常见恶性肿瘤[1]，严重威胁着妇女的健康与生命。宫颈癌的发生与发展是一个多阶段、多基因变异的结果，癌基因的激活与抑癌基因的失活在这一过程中起了重要作用。FEZ1基因是从8p22上分离而得出的一个抑癌基因，在一些恶性肿瘤中表现为抑制肿瘤发生发展的作用[2]。研究已证实，FEZ1在多种恶性肿瘤组织如乳腺癌、卵巢癌、肺癌等中，FEZ1均存在不同程度的缺失或表达减少，但其在宫颈鳞癌中的作用尚不明确[3-5]。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集2005年6月-2012年6月在本院住院患者的宫颈组织蜡块共208例，其中宫颈鳞癌102例，CIN66例，正常宫颈组织40例。术前患者均未接受放疗及化疗。102例宫颈鳞癌患者中，年龄34～65岁，中位年龄43岁，其中浸润浅层42例，深层60例；按WHO标准分级，高分化32例，中分化44例、低分化26例；按国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）临床分期（2003）标准进行分期，Ⅰ期56例，Ⅱ期21例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；伴淋巴结转移的33例，无淋巴结转移的69例。CIN66例，其中CINⅠ级12例，CINⅡ级24例，CINⅢ级30例；正常宫颈组织40例（同期住院因子宫良性疾病行子宫全切术，术后病理证实宫颈正常者）。
1.2 主要试剂及试剂盒 FEZ1鼠抗人多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ生物公司，工作浓度为1：50；SP免疫组化试剂盒（PV9000）购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 IHC染色 采用免疫组化SP法，步骤如下：石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，PBS清洗，抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗，山羊血清封闭，滴加一抗工作液（1∶50），室温孵育10 min后置于湿盒内，4 ℃冰箱过夜（12 h），PBS清洗，滴加生物素标记的二抗工作液，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，PBS冲洗，DAB工作液显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照，结果阴性。
1.4 IHC结果判定 FEZ1蛋白阳性信号为棕黄色颗粒样物质，主要位于细胞质，少部分位于细胞核；参照有关文献[6]，在高倍视野下（400×）随机选取5个视野（每个视野观察不少于200个细胞），按阳性细胞所占的百分比及着色强度进行结果判定：（1）按着色强度评分：0分为无着色；1分为浅黄色；2分为黄色；3分为棕黄色。（2）按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：0分为阴性，1分为阳性细胞数≤10%，2分为阳性细胞数11%～50%，3分为阳性细胞数51%～75%，4分为阳性细胞数>75%。取（1）、（2）两项评分的乘积作为总积分，0～3分为阴性（-），3分以上为阳性（+）。
1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0软件处理所有数据，两样本率的比较采用四格表资料的 字2检验；多样本率的比较采用行列表资料的 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 FEZ1蛋白在宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织中的表达 FEZ1蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，主要位于细胞质，在宫颈正常黏膜上皮中组织中，FEZ1阳性细胞存在于上皮全层，CIN中则以弥散分布为主，在宫颈鳞癌中常表现为淡染或无着色，见图1～3。FEZ1蛋白在正常宫颈组织、CIN及宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为92.5%、68.2%和52.0%（P<0.05）。
2.2 宫颈鳞癌组织中FEZ1蛋白的表达与其临床病理特征的关系 在宫颈鳞癌组织中，FEZ1蛋白的表达随着癌组织分化程度的降低而显著降低（P<0.05），而与年龄、浸润深度、临床分期、淋巴结转移无关（P>0.05）。
3 讨论
抑癌基因功能的缺失在肿瘤的发生与演进过程中起着重要作用。FEZ1基因是从8p22上分离而得出的一个抑癌基因。研究显示，FEZ1在多种正常组织中普遍表达，而在许多恶性肿瘤组织如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌等中均存在不同程度的缺失或表达减少[3-5，7]。FEZ1基因可能通过促进凋亡，影响细胞周期，使细胞产生G2/M期阻滞；抑制细胞生长和调节有丝分裂而发挥抑癌作用的[8]。
Vecchione等[9]研究表明，FEZ1蛋白表达缺失或显著减少的病例在原发性胃癌中占44%（39/88），且与不同的组织类型有显著相关性，而在研究的8例胃癌细胞系中几乎均检测不到FEZ1蛋白的表达；在原发性膀胱移行细胞癌中占62%（37/60）并与肿瘤的病理分级显著相关。在对肺癌的研究中，FEZ1蛋白表达缺失或显著减少的病例占68%（70/103）并与肿瘤分级呈正相关[2，10]。王洪兴等[11]报道FEZ1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率（55.6%）明显低于正常胃组织（86.1 %），并且其在胃癌组织中的阳性表达率与分化程度密切相关（P<0.05）。以上研究均表明，FEZ1蛋白表达缺失或下降在多种人类肿瘤的发生中起着重要作用。研究还显示，将FEZ1基因转染入FEZ1阴性表达的乳腺癌细胞系（MCF7）中，发现转染入FEZ1基因的实验组细胞与对照组相比增殖能力明显下降。动物实验同样发现转染入FEZ1基因的MCF7细胞的肿瘤形成能力也较对照组明显下降[12]，提示FEZ1的表达在体外可抑制细胞增殖，在体内可抑制肿瘤的形成。本实验结果显示，FEZ1蛋白在宫颈正常组织中的阳性表达率显著高于其在宫颈鳞癌及CIN组织中的阳性表达率（P<0.05），与上述研究结果相似，进一步说明FEZ1是一重要的抑癌基因，其表达缺失或减少与宫颈鳞癌的发生密切相关。 此外，笔者还研究了FEZ1蛋白的表达与宫颈鳞癌主要临床病理特征间的关系，结果显示，在宫颈鳞癌组织中，FEZ1蛋白的表达随着癌组织分化程度的降低而显著降低（P<0.05），而与患者年龄、癌组织的浸润深度、淋巴结转移及临床分期无关（P>0.05），这一结果说明FEZ1表达缺失或下降可能与宫颈鳞癌的发生、发展密切相关。Vecchione等[10]研究FEZ1在膀胱癌中的表达时发现，与正常移行上皮比较，60%的原发膀胱癌的FEZ1蛋白表达减少或缺失，并且与肿瘤的分期之间存在显著相关性。Nigg[13]在对11例肾集合管癌的研究中发现有7例（64%）存在FEZ1蛋白的表达减少或缺失，并且与淋巴结转移密切相关。原志庆等[14]研究FEZ1基因在甲状腺乳头状癌中的表达也发现类似的结果，FEZ1蛋白在甲状腺乳头状癌和甲状腺腺瘤中的阳性表达率明显低于正常甲状腺组织，并且其在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率与临床分期和淋巴结转移相关（P<0.05）。
综上所述，在宫颈鳞癌中，FEZ1基因表达缺失或下调，且其阳性表达与宫颈鳞癌的组织学分级有关，提示FEZ1基因不仅与宫颈癌的发生与演进有关，而且可能成为宫颈癌一个新的治疗靶点，但FEZ1基因的表达缺失或下调的原因及机制还需要进一步去研究和探讨，这对于完善宫颈癌的发生机制并作为肿瘤诊断和指导个性化治疗的分子靶点具有重要意义。
参考文献
[1] Arbyn M，Castellsagué X，de Sanjosé S，et al.Worldwide burden of cervical cancer in 2008[J].Ann Oncol，2011，22（12）：2675-2686.
[2] Ishii H，Baffa R，Numata S I，et al.The FEZ1 gene at chromosome 8p22 encodes aleucine-zipper protein，and its expression is altered in multiple human tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（7）：3928-3933.
[3] Chen L，Zhu Z，Sun X，et al.Down-regulation of tumor suppressor gene FEZ1/LZTS1 in breast carcinoma involves promoter methylation and associates with metastasis[J].Breast Cancer Res Treat，2009，116（3）：471-478.
[4] Califano D，Pignata S，Pisano C，et al.FEZ1/LZTS1 protein expression in ovarian cancer[J].J Cell Physiol，2010，222（2）：382-386.
[5] Nonaka D，Fabbri A，Roz L，et al.Reduced FEZ1/LZTS1 expression and outcome prediction in lung cancer[J].Cancer Res，2005，65（4）：1207-1212.
[6]许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志，1996，6（4）：229-231.
[7] Ono K，Uzawa K，Nakatsuru M，et al.Down-regulation of FEZ1/LZTS1 gene with frequent loss of heterozygosity in oral squamous cell carcinomas[J].Int J Oncol，2003，23（2）：297-302.
[8] Ishii H，Vecchione A，Murakumo Y，et al.Fezl/LZTS1 gene at 8p22 suppresses cancer cell growth and regulates mitosis[J].Procnatl Acad Sci USA，2001，98（18）：10 374-10 379.
[9] Vecchione A，Ishii H，Shiao Y H，et al.Fez1/lzts1 alterations in gastric carcinoma[J].Clin Cancer Res，2001，7（6）：1546-1552.
[10] Vecchione A，Ishii H，Baldassarre G，et al.FEZ1/LZTS1 is down-regulated in high-grade bladder cancer，and its restoration suppresses tumorigenicity in transitional cell carcinoma cells[J].Am J Pathol，2002，160（4）：1345-1352.
[11]王洪兴，李娜，秦川，等.FEZ1蛋白和mRNA在胃癌组织中的表达及其意义[J].肿瘤防治研究，2009，36（6）：497-499，507.
[12] Pines J.Mitosis：a matter of getting rid of the right protein at the right time[J].Trends Cell Biol，2006，16（1）：55-63.
[13] Nigg E A.Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（1）：21-32.
[14]原志庆，陈晓磊，李娜，等.FEZ1基因在甲状腺乳头状癌中的表达及其意义[J].重庆医科大学学报，2011，36（4）：437-440.
（收稿日期：2014-05-14） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 FEZ1； 宫颈鳞癌； 免疫组织化学
宫颈癌是女性生殖系统第二大常见恶性肿瘤[1]，严重威胁着妇女的健康与生命。宫颈癌的发生与发展是一个多阶段、多基因变异的结果，癌基因的激活与抑癌基因的失活在这一过程中起了重要作用。FEZ1基因是从8p22上分离而得出的一个抑癌基因，在一些恶性肿瘤中表现为抑制肿瘤发生发展的作用[2]。研究已证实，FEZ1在多种恶性肿瘤组织如乳腺癌、卵巢癌、肺癌等中，FEZ1均存在不同程度的缺失或表达减少，但其在宫颈鳞癌中的作用尚不明确[3-5]。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集2005年6月-2012年6月在本院住院患者的宫颈组织蜡块共208例，其中宫颈鳞癌102例，CIN66例，正常宫颈组织40例。术前患者均未接受放疗及化疗。102例宫颈鳞癌患者中，年龄34～65岁，中位年龄43岁，其中浸润浅层42例，深层60例；按WHO标准分级，高分化32例，中分化44例、低分化26例；按国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）临床分期（2003）标准进行分期，Ⅰ期56例，Ⅱ期21例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；伴淋巴结转移的33例，无淋巴结转移的69例。CIN66例，其中CINⅠ级12例，CINⅡ级24例，CINⅢ级30例；正常宫颈组织40例（同期住院因子宫良性疾病行子宫全切术，术后病理证实宫颈正常者）。
1.2 主要试剂及试剂盒 FEZ1鼠抗人多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ生物公司，工作浓度为1：50；SP免疫组化试剂盒（PV9000）购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 IHC染色 采用免疫组化SP法，步骤如下：石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，PBS清洗，抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗，山羊血清封闭，滴加一抗工作液（1∶50），室温孵育10 min后置于湿盒内，4 ℃冰箱过夜（12 h），PBS清洗，滴加生物素标记的二抗工作液，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，PBS冲洗，DAB工作液显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照，结果阴性。
1.4 IHC结果判定 FEZ1蛋白阳性信号为棕黄色颗粒样物质，主要位于细胞质，少部分位于细胞核；参照有关文献[6]，在高倍视野下（400×）随机选取5个视野（每个视野观察不少于200个细胞），按阳性细胞所占的百分比及着色强度进行结果判定：（1）按着色强度评分：0分为无着色；1分为浅黄色；2分为黄色；3分为棕黄色。（2）按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：0分为阴性，1分为阳性细胞数≤10%，2分为阳性细胞数11%～50%，3分为阳性细胞数51%～75%，4分为阳性细胞数>75%。取（1）、（2）两项评分的乘积作为总积分，0～3分为阴性（-），3分以上为阳性（+）。
1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0软件处理所有数据，两样本率的比较采用四格表资料的 字2检验；多样本率的比较采用行列表资料的 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 FEZ1蛋白在宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织中的表达 FEZ1蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，主要位于细胞质，在宫颈正常黏膜上皮中组织中，FEZ1阳性细胞存在于上皮全层，CIN中则以弥散分布为主，在宫颈鳞癌中常表现为淡染或无着色，见图1～3。FEZ1蛋白在正常宫颈组织、CIN及宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为92.5%、68.2%和52.0%（P<0.05）。
2.2 宫颈鳞癌组织中FEZ1蛋白的表达与其临床病理特征的关系 在宫颈鳞癌组织中，FEZ1蛋白的表达随着癌组织分化程度的降低而显著降低（P<0.05），而与年龄、浸润深度、临床分期、淋巴结转移无关（P>0.05）。
3 讨论
抑癌基因功能的缺失在肿瘤的发生与演进过程中起着重要作用。FEZ1基因是从8p22上分离而得出的一个抑癌基因。研究显示，FEZ1在多种正常组织中普遍表达，而在许多恶性肿瘤组织如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌等中均存在不同程度的缺失或表达减少[3-5，7]。FEZ1基因可能通过促进凋亡，影响细胞周期，使细胞产生G2/M期阻滞；抑制细胞生长和调节有丝分裂而发挥抑癌作用的[8]。
Vecchione等[9]研究表明，FEZ1蛋白表达缺失或显著减少的病例在原发性胃癌中占44%（39/88），且与不同的组织类型有显著相关性，而在研究的8例胃癌细胞系中几乎均检测不到FEZ1蛋白的表达；在原发性膀胱移行细胞癌中占62%（37/60）并与肿瘤的病理分级显著相关。在对肺癌的研究中，FEZ1蛋白表达缺失或显著减少的病例占68%（70/103）并与肿瘤分级呈正相关[2，10]。王洪兴等[11]报道FEZ1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率（55.6%）明显低于正常胃组织（86.1 %），并且其在胃癌组织中的阳性表达率与分化程度密切相关（P<0.05）。以上研究均表明，FEZ1蛋白表达缺失或下降在多种人类肿瘤的发生中起着重要作用。研究还显示，将FEZ1基因转染入FEZ1阴性表达的乳腺癌细胞系（MCF7）中，发现转染入FEZ1基因的实验组细胞与对照组相比增殖能力明显下降。动物实验同样发现转染入FEZ1基因的MCF7细胞的肿瘤形成能力也较对照组明显下降[12]，提示FEZ1的表达在体外可抑制细胞增殖，在体内可抑制肿瘤的形成。本实验结果显示，FEZ1蛋白在宫颈正常组织中的阳性表达率显著高于其在宫颈鳞癌及CIN组织中的阳性表达率（P<0.05），与上述研究结果相似，进一步说明FEZ1是一重要的抑癌基因，其表达缺失或减少与宫颈鳞癌的发生密切相关。 此外，笔者还研究了FEZ1蛋白的表达与宫颈鳞癌主要临床病理特征间的关系，结果显示，在宫颈鳞癌组织中，FEZ1蛋白的表达随着癌组织分化程度的降低而显著降低（P<0.05），而与患者年龄、癌组织的浸润深度、淋巴结转移及临床分期无关（P>0.05），这一结果说明FEZ1表达缺失或下降可能与宫颈鳞癌的发生、发展密切相关。Vecchione等[10]研究FEZ1在膀胱癌中的表达时发现，与正常移行上皮比较，60%的原发膀胱癌的FEZ1蛋白表达减少或缺失，并且与肿瘤的分期之间存在显著相关性。Nigg[13]在对11例肾集合管癌的研究中发现有7例（64%）存在FEZ1蛋白的表达减少或缺失，并且与淋巴结转移密切相关。原志庆等[14]研究FEZ1基因在甲状腺乳头状癌中的表达也发现类似的结果，FEZ1蛋白在甲状腺乳头状癌和甲状腺腺瘤中的阳性表达率明显低于正常甲状腺组织，并且其在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率与临床分期和淋巴结转移相关（P<0.05）。
综上所述，在宫颈鳞癌中，FEZ1基因表达缺失或下调，且其阳性表达与宫颈鳞癌的组织学分级有关，提示FEZ1基因不仅与宫颈癌的发生与演进有关，而且可能成为宫颈癌一个新的治疗靶点，但FEZ1基因的表达缺失或下调的原因及机制还需要进一步去研究和探讨，这对于完善宫颈癌的发生机制并作为肿瘤诊断和指导个性化治疗的分子靶点具有重要意义。
参考文献
[1] Arbyn M，Castellsagué X，de Sanjosé S，et al.Worldwide burden of cervical cancer in 2008[J].Ann Oncol，2011，22（12）：2675-2686.
[2] Ishii H，Baffa R，Numata S I，et al.The FEZ1 gene at chromosome 8p22 encodes aleucine-zipper protein，and its expression is altered in multiple human tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（7）：3928-3933.
[3] Chen L，Zhu Z，Sun X，et al.Down-regulation of tumor suppressor gene FEZ1/LZTS1 in breast carcinoma involves promoter methylation and associates with metastasis[J].Breast Cancer Res Treat，2009，116（3）：471-478.
[4] Califano D，Pignata S，Pisano C，et al.FEZ1/LZTS1 protein expression in ovarian cancer[J].J Cell Physiol，2010，222（2）：382-386.
[5] Nonaka D，Fabbri A，Roz L，et al.Reduced FEZ1/LZTS1 expression and outcome prediction in lung cancer[J].Cancer Res，2005，65（4）：1207-1212.
[6]许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志，1996，6（4）：229-231.
[7] Ono K，Uzawa K，Nakatsuru M，et al.Down-regulation of FEZ1/LZTS1 gene with frequent loss of heterozygosity in oral squamous cell carcinomas[J].Int J Oncol，2003，23（2）：297-302.
[8] Ishii H，Vecchione A，Murakumo Y，et al.Fezl/LZTS1 gene at 8p22 suppresses cancer cell growth and regulates mitosis[J].Procnatl Acad Sci USA，2001，98（18）：10 374-10 379.
[9] Vecchione A，Ishii H，Shiao Y H，et al.Fez1/lzts1 alterations in gastric carcinoma[J].Clin Cancer Res，2001，7（6）：1546-1552.
[10] Vecchione A，Ishii H，Baldassarre G，et al.FEZ1/LZTS1 is down-regulated in high-grade bladder cancer，and its restoration suppresses tumorigenicity in transitional cell carcinoma cells[J].Am J Pathol，2002，160（4）：1345-1352.
[11]王洪兴，李娜，秦川，等.FEZ1蛋白和mRNA在胃癌组织中的表达及其意义[J].肿瘤防治研究，2009，36（6）：497-499，507.
[12] Pines J.Mitosis：a matter of getting rid of the right protein at the right time[J].Trends Cell Biol，2006，16（1）：55-63.
[13] Nigg E A.Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（1）：21-32.
[14]原志庆，陈晓磊，李娜，等.FEZ1基因在甲状腺乳头状癌中的表达及其意义[J].重庆医科大学学报，2011，36（4）：437-440.
（收稿日期：2014-05-14） （本文编辑：欧丽）