【摘 要】
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目的:构建表达脂肪与肥胖相关(fat mass and obesity associated,FTO)基因的重组质粒,并检测其对小鼠肾小球系膜细胞(mice mesangial cell,MMC)N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰及增殖
【机 构】
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南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科,江苏淮安,223300;南京医科大学病原生物学系,江苏南京,211166
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目的:构建表达脂肪与肥胖相关(fat mass and obesity associated,FTO)基因的重组质粒,并检测其对小鼠肾小球系膜细胞(mice mesangial cell,MMC)N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰及增殖能力的影响.方法:PCR法扩增FTO基因片段,并将其插入表达载体pCMV-MCS-EGFP质粒中以构建重组质粒pCMV-FTO.将目的质粒pCMV-FTO及对照质粒pCMV分别转染MMC,采用qRT-PCR法检测FTO mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测细胞FTO蛋白和相关增殖标志物的表达,CCK8法检测细胞增殖,m6A RNA甲基化定量试剂盒检测m6A含量.结果:菌落PCR鉴定以及测序结果证实重组质粒pCMV-FTO构建成功.RT-qP-CR及蛋白印迹结果显示转染目的质粒pCMV-FTO后FTO表达明显增加.过表达FTO后,m6A含量、细胞增殖水平及细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白水平均显著下降.结论:FTO可以降低MMC中m6A修饰水平及抑制细胞增殖.
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