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摘要 为了筛选出对小地老虎具有增效作用的复配药剂组合，室内采用浸叶法测定了氯虫苯甲酰胺与高效氯氟氰菊酯、噻虫嗪、虫螨腈、毒死蜱、甲维盐、乙基多杀菌素复配对小地老虎3龄幼虫的联合毒力，并用共毒因子法与共毒系数法相结合评价了复配组合的联合作用。利用共毒因子法定性筛选出共毒因子大于20的配比共16组，进一步通过共毒系数法定量筛选出共毒系数大于120的复配组合，其中具有增效作用的配比有18组。氯虫苯甲酰胺与高效氯氟氰菊酯、虫螨腈、毒死蜱、甲维盐、乙基多杀菌素、噻虫嗪按6∶5、1∶2、1∶1、3∶4、3∶5、3∶8复配时增效作用最显著，其共毒系数分别为220.28、214.15、298.79、171.85、201.90、319.64。
关键词 小地老虎； 农药复配； 共毒因子； 共毒系数
中图分类号： S 433.82
文献标识码： B
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017471
Abstract In order to screen out the combination of insecticide complex agents with synergistic effect onAgrotis ipsilon， the co-toxicity of chlorantraniliprole withlambda-cyhalothrin， thiamethoxam， chlorfenapyr， chlorpyrifos， emamectin benzoate and spinetoram against 3rd-instar ofAgrotis ipsilonwere determined with leaf dipping method， and the combined effects of the combinations were evaluated by the method of co-toxicity factor and co-toxicity coefficient in the laboratory. Sixteen combinations of the co-toxicity factor more than 20 and eighteen combinations of co-toxicity coefficient greater than 120 were screened qualitatively by co-toxicity factor method and co-toxicity coefficient method， respectively. The results showed that chlorantraniliprole withlambda-cyhalothrin， chlorfenapyr， chlorpyrifos， emamectin benzoate， spinetoram and thiamethoxam， with ratio of 6∶5， 1∶2， 1∶1， 3∶4， 3∶5， 3∶8，respectively， showed significant synergistic effect， and the co-toxicity coefficient （CTC） was 220.28， 214.15， 298.79， 171.85， 201.90 and 319.64， respectively.
Key words Agrotis ipsilon； combination of insecticides； co-toxicity factor； co-toxicity coefficient
小地老虎Agrotis ipsilon（Rottemberg） 屬鳞翅目夜蛾科，俗称土蚕、地剪、切根虫等，是一种多食性的世界性农业害虫，在我国各省份均有分布，其寄主十分广泛，主要为害玉米、蔬菜等100多种农作物[1]。长期以来，对该害虫的防治以化学药剂防治为主[2]。全球气候变暖和农业种植制度（免耕技术、轮作制度等）的改变为小地老虎提供了隐蔽的场所，加重了其为害程度，导致作物产量损失严重。而且小地老虎具有迁徙性强、抗药性发展快等特点，近年来该虫在我国发生为害日趋严重[3]。
氯虫苯甲酰胺是双酰胺类杀虫剂，由杜邦公司发现并开发，该药剂对鳞翅目害虫高效，对哺乳动物低毒，作用机制独特而与常规杀虫剂无交互抗性[4]。但广泛应用后害虫产生抗性风险也在逐步增加[5]，许多鳞翅目害虫已对其产生了严重的抗药性。国内外关于小地老虎生物学、生态学及防治药剂的报道有很多[6-11]，但有关其对药剂的抗性及其生化机制以及新药剂的开发等方面研究仍存在不足[12]。研究表明小地老虎对有机磷类、菊酯类等多种药剂已产生了很高的抗性，有些种类的杀虫剂对其甚至完全失效[13-16]。氯虫苯甲酰胺作为当前防治鳞翅目害虫的主要药剂，其长期大量施用必会加速小地老虎的抗药性发展，将对农作物的安全生产造成严重威胁。因此，研究农药复配制剂对于延长新农药品种使用寿命、缓解抗性产生、提高药效、扩大防治谱、保证环境安全和降低防治成本等具有重要的意义[17]。
为筛选出对小地老虎具有增效作用的复配药剂组合，并明确其在不同配比下的联合作用效果。本研究在测定氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、噻虫嗪、毒死蜱、虫螨腈、甲维盐、乙基多杀菌素对小地老虎3龄幼虫室内毒力的基础上，采用等效线法设置配比，并以共毒因子法进行定性筛选与共毒系数法进行定量分析相结合的方法筛选出具有增效活性的配方组合，明确其最佳复配比例及联合毒力效果，旨在为田间小地老虎的化学防治和抗性治理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 试验药剂及来源 供试杀虫剂均为原药，包括95.3%氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole），上海杜邦农化有限公司；96%高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothrin），山东潍坊润丰化工股份有限公司；98%噻虫嗪（thiamethoxam），浙江禾本科技有限公司；95%毒死蜱（chlorpyrifos），浙江新安化工集团股份有限公司；90%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（emamectin benzoate），后文简称甲维盐，南京红太阳股份有限公司；81.2%乙基多杀菌素（spinetoram），美国陶氏益农公司；95%虫螨腈（chlorfenapyr），德国拜耳作物科学公司；溶剂：99%丙酮（acetone），天津大茂化学试剂厂；乳化剂：TritonX-100，北京雅安达生物技术有限公司。
1.1.2 供试虫源
将田间诱集的小地老虎Agrotis ipsilon（Rottemberg）成虫，在室内条件下饲养至产卵，成虫喂食20%的蜂蜜水。初孵幼虫（1～2龄）喂食新鲜甘蓝叶片，3龄以后转入12孔细胞培养板（孔径22 mm，孔深18 mm），并喂食新鲜的人工饲料，老熟幼虫转入平底试管（直径22 mm，高80 mm）内饲养直至化蛹。试虫饲养条件：人工智能养虫室，温度为（27±1）℃、相对湿度为75%±5%、光周期为L∥D=16 h∥8 h、光照强度3 500 lx。选择同一批生长一致的新蜕皮（12 h内）3龄幼虫进行室内毒力测定。
1.2 试验方法
1.2.1 单剂毒力测定
室内毒力测定采用浸叶法。将供试药剂用丙酮配制成母液，再用0.05% 的TritonX-100水溶液将药剂等比稀释至试验浓度。将从未用药的鲜嫩甘蓝叶表面蜡质层洗去，晾干，用直径1.5 cm打孔器打成的小叶碟（避开主叶脉），将叶碟分别在不同处理药液中浸泡10 s，取出后在吸水纸上晾干（25℃，2 h），然后放入24孔细胞培养板（孔径16 mm，孔深17 mm）中，每孔放3片叶碟，每孔接入1头新蜕皮（12 h 内）的3龄幼虫，每个处理重复4 次，每个重复24 头试虫，以0.05% 的TritonX-100水溶液作对照。
将处理试虫置于温度（27±1）℃、相对湿度75%±5%、光周期L∥D=16 h∥8 h 的实验室条件下饲养观察，48 h后检查死亡虫数，用毛笔轻触无反应者视为死亡。根据试验要求和药剂特点，可以适当延长或缩短检查时间。
1.2.2 共毒因子的测定
采用Mansour等[18]的共毒因子法定性筛选出共毒因子大于20的增效配比。假设经毒力测定A、B两单剂的致死中浓度分别为a和b，选择具有增效作用的5个配比，这5个配比即为等效线法中相加作用线的六等分点，可表示为a/5b、a/2b、a/b、2a/b、5a/b。这5个配比混剂的浓度分别为（a 5b）/6、（a 2b）/3、（a b）/2、（2a b）/3、（5a b）/6，通過共毒因子法评价A B混剂的增效作用效果。具体配制方法是将各单剂配制成致死中浓度药液，再按体积比1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1混合即得不同配比混剂药液，用于初步评价氯虫苯甲酰胺与6种药剂按不同比例复配的联合作用。
共毒因子=（实测死亡率-理论死亡率）/理论死亡率×100，共毒因子>20表示有增效作用；-20≤共毒因子≤20表示相加作用；共毒因子<-20表示拮抗作用。生物测定方法同1.2.1。
1.2.3 共毒系数的测定
以共毒因子法筛选出共毒因子大于20的配比作参考，并在该配比范围内进一步细化配比，再根据死亡率设置5～7个浓度梯度测定其对小地老虎3龄幼虫的联合毒力，求出LC50及线性回归方程，通过参照Sun等[19]的共毒系数法计算出共毒系数（CTC），筛选出共毒系数大于120的最佳增效配比。
相对毒力指数（TI）=（标准药剂LC50/供试药剂LC50）×100；
混剂实际毒力指数（ATI）=（标准药剂LC50/供试药剂LC50）×100；
混剂理论毒力指数（TTI）=ATI（A）×药剂A在混剂中百分含量 ATI（B）×药剂B在混剂中的百分含量；
共毒系数（CTC）=（混剂实际毒性指数ATI/混剂理论毒性指数TTI）×100，大于120为增效作用；共毒系数80～120为相加作用；小于80为拮抗作用。计算共毒系数时使用复配组合中LC50较大的单剂为标准杀虫剂。生物测定方法同1.2.1。
1.3 数据处理
根据小地老虎的存活情况，不同药剂处理间的死亡率用Abbott’s公式校正，计算出死亡率，采用DPS 8.01软件和 Microsoft Excel 2010软件对数据进行统计分析，得出毒力回归方程、致死中浓度LC50、95%置信区间（95%CI）、相关系数r、相对毒力指数（TI）及相关参数。
2 结果与分析
2.1 单剂毒力测定结果
7种杀虫剂对小地老虎3龄幼虫毒力测定结果（表1）表明，氯虫苯甲酰胺的毒力最高，其LC50为2.725 6 mg/L，噻虫嗪的毒力最低，其LC50为37.582 6 mg/L，毒力大小顺序为：氯虫苯甲酰胺>高效氯氟氰菊酯>虫螨腈>毒死蜱>甲维盐>乙基多杀菌素>噻虫嗪。
2.2 共毒因子法定性筛选结果
采用共毒因子法测定氯虫苯甲酰胺与6种药剂按不同比例复配对小地老虎3龄幼虫的毒力（表2）。在试验的6个复配组合中，共毒因子大于20的组合共有16组，其中与高效氯氟氰菊酯3∶10、3∶5、6∶5复配时共毒因子分别为37.89、30.67、40.17；与虫螨腈1∶8、1∶2复配时共毒因子分别为41.83、45.59；与毒死蜱1∶25、1∶10、1∶5、2∶5、1∶1复配时的共毒因子分别为30.97、27.65、26.96、33.55、38.45；与甲维盐3∶40、3∶10、3∶4复配时共毒因子分别为31.61、25.90、38.37；与乙基多杀菌素3∶5复配时共毒因子为31.54；与噻虫嗪3∶20、3∶8复配时共毒因子分别为27.29、41.69。 2.3 共毒系数法定量筛选结果
在共毒因子法定性最佳配比组合筛选的基础上，进一步通过共毒系数法测定不同配比组合的增效作用。由共毒系数法定量筛选的结果（表3）可知，在所设配比中，氯虫苯甲酰胺与高效氯氟氰菊酯1∶4、3∶10、6∶5复配时共毒系数分别为133.21、207.54、220.28，其中以6∶5复配时增效作用最显著，配比3∶5表现为相加作用，配比2∶1为拮抗作用；与虫螨腈1∶9、1∶8、1∶2、1∶1复配时共毒系数分别为123.54、164.92、214.15、125.46，以1∶2复配时增效最显著，1∶5为拮抗作用；与毒死蜱1∶25、1∶10、2∶5、1∶1复配时共毒系数分别为158.18、125.88、204.79、298.79，以1∶1复配增效最显著，1∶5为拮抗作用；与甲维盐3∶40、3∶4复配时共毒系数分别为156.12、171.85，以3∶4复配增效最显著，1∶2为拮抗作用；与乙基多杀菌素3∶5、3∶4复配时共毒系数分别为201.90、125.20，以3∶5复配增效最显著，1∶1为拮抗作用；与噻虫嗪3∶20、3∶8、1∶2复配时共毒系数分别为147.20、319.64、196.54，以3∶8复配增效最显著，1∶5为拮抗作用。氯虫苯甲酰胺与6种不同类别药剂复配时均有增效作用的组合，其中有部分共毒因子大于20的组合的共毒系数小于120，即共毒因子大于20的复配组合不一定具有增效作用。
3 结论与讨论
国内常用的农药混用联合作用评价方法有很多，其中孙云沛的共毒系数法是农药联合作用的主要评价方法之一[20]，该方法不仅可以知道混剂是否增效，同时还可知道混剂的增效程度。很多研究采用共毒系数法评价几种药剂复配对靶标昆虫的联合毒力[21-25]，然而，该方法工作量大，所需靶标昆虫虫量大，且测定结果有一部分组合无增效作用，难以得到最佳的配比，已不适于评价农药的联合作用，其评价结果难以指导农药的实际生产和应用[26]。而共毒因子法具有省时、省工、省材料等特点，此法只能确定每个复配组合是否增效，但不可能知道复配剂对靶标昆虫的实际毒力和增效程度[27]。现常用共毒因子与共毒系数相结合的方法评价农药的联合作用，该方法通过共毒因子法对大量的配比进行定性筛选，再用共毒系数法对共毒因子大于20的配比组合进行定量筛选，得到具有增效作用的最佳配比和各配比的增效程度。但也有结果表明，通过共毒因子法得到共毒因子大于20的增效组合后，再用共毒系数法对共毒因子大于20复配组合筛选时却没有增效作用[28-29]。本研究也出现了这种情况。
双酰胺类杀虫剂由于低毒、靶标独特、应用方法多样，已成为害虫综合治理战略中的一类重要药剂[30]。氯虫苯甲酰胺对鳞翅目害虫幼虫毒力明显高于高效氯氰菊酯、噻虫嗪、阿维菌素、乙基多杀菌素、茚虫威等药剂，且对非靶标生物表现出了很强的毒力选择性[12，31-32]，刘同金等[33]和陆俊姣等[34]发现氯虫苯甲酰胺对玉米田小地老虎的田间防治效果达到90%以上，表明氯虫苯甲酰胺是防治小地老虎等鳞翅目害虫最为高效的药剂之一。但由于杀虫剂频繁施用，小地老虎的抗药性发展十分迅速，现已对有机磷类和拟除虫菊酯类等多种杀虫剂产生了很高的抗药性，有些种类的杀虫剂甚至完全失效[15]。随着氯虫苯甲酰胺田间的大量使用，研究发现部分地区小菜蛾Plutella xylostella（L.）、甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）和斜纹夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）等鳞翅目害虫已对其产生了不同程度的抗药性[35-37]。如果在小地老虎的防治上不加节制地频繁使用氯虫苯甲酰胺，也会加速其抗药性的发展。因此，加快新农药品种的开发和对现有杀虫剂进行科学合理混配已成为抗药性治理和害虫综合防治的有效手段。
本研究以氯虫苯甲酰胺为主干药剂，分别与其他6种不同类别杀虫剂进行复配，通过等效线法选择具有增效作用的5个配比，采用共毒因子法筛选出共毒因子大于20的复配组合，然后进一步细化配比，通过共毒系数法筛选出共毒系数大于120的最佳复配组合。研究结果将为防治小地老虎复配剂配方的筛选和抗性治理提供理论基础和技术支持，有关氯虫苯甲酰胺与几种药剂复配对小地老虎的增效作用机理及增效配方在实际生产中的应用效果，有待进一步试验验证。
参考文献
[1] 魏鸿钧， 张昭良， 王荫长. 中国地下害虫[M]. 上海：上海科学技术出版社， 1989：273-376.
[2] NAGATA T. Insecticide resistance and chemical control of the brown planthopper，Nilaparvata lugensStl （Homoptera： Delphacidae）[J]. Bulletin of the Kyushu Agricultural Experiment Station， 1982， 22（1）：49-164.
[3] 向玉勇，楊茂发，李子忠.小地老虎室内连续饲养12代的化蛹率、羽化率和性比观察[J].黄山学院学报，2010，12（5）：67-69.
[4] 徐尚成， 俞幼芬， 王晓军， 等. 新杀虫剂氯虫苯甲酰胺及其研究开发进展[J]. 现代农药， 2008， 7（5）：8-11.
[5] 冯聪， 宋玉泉， 班兰凤. 鱼尼汀受体类杀虫剂抗药性研究进展[J]. 农药， 2014， 53（7）：469-481.
[6] RINGS R W， ARNOLD F J， KEASTER A J， et al. A worldwide， annotated bibliography of the black cutworm，Agrotis ipsilon （Hüfnagel）[M]. Ohio： Ohio Agricultural Research and Development Center， 1974：1-106. [7] 陈国生. 六索线虫防治小地老虎的小区试验[J]. 生物防治通报， 1989， 5（3）：125-126.
[8] 李永禧.小地老虎生活习性及防治[J].昆虫知识，1964（1）：1-5.
[9] 韩召军. 小地老虎对几类杀虫剂的毒力反应及其抗药性变化[J]. 植物保护学报， 1986，13（2）：125-130.
[10]COSSENTINE J E. The experimental evolution on application microspondia against Agrotis ipsilon（Rottemberg）[J]. Entomophaga， 1987， 31（4）：323-330.
[11]SALAMA H S.Strengthen control result of Bt againstAgrotis ipsilon（Rottemberg）[J]. Journal of Applied Entomology， 1989， 108（4）：372-380.
[12]于伟丽. 防治小地老虎高效药剂筛选及对土壤生物安全性评价[D]. 泰安：山东农业大学， 2012.
[13]唐振華. 我国农业害虫抗药性及其对策[J]. 植物保护， 1983， 9（1）：22-24.
[14]龚坤元.害虫的抗药性[J].昆虫知识，1982（1）：43-46.
[15]向玉勇，杨茂发. 小地老虎在我国的发生危害及防治技术研究[J]. 安徽农业科学， 2008， 36（33）：14636-14639.
[16]储志坚， 汪济民， 孙卫东， 等. 乐斯本15%颗粒剂防治菊花地下害虫药效试验[J]. 安徽农学通报， 2007（4）：200.
[17]金剑雪， 金道超， 李文红， 等. 防治白背飞虱的农药复配增效配方筛选[J]. 植物保护， 2017， 43（1）：199-204.
[18]MANSOUR N A，ELDEFRAWI M E，TOPPOZADA A， et al. Toxicological studies on the egyptian cotton leaf worm，Prodenia litura. Ⅵ.Potentiation and antagonism of organophosphorus and carbamate insecticides [J].Journal of Economic Entomology，1966，59（2）：307-311.
[19]SUN Yunpei， Johnson E R.Analysis of joint action of insecticides against house flies [J]. Journal of Economic Entomology， 1960， 53（5）：887-892.
[20]陈立， 徐汉虹， 李云宇， 等. 农药复配最佳增效配方筛选方法的探讨[J]. 植物保护学报， 2000， 27（4）：349-354.
[21]乔康， 王开运， 石绪根. 几种杀虫剂及其混剂对褐飞虱的毒力测定[J]. 农药研究与应用， 2010（2）：19-21.
[22]刘奎， 付步礼， 邱海燕， 等. 几种杀虫剂及其混配对瓜实蝇成虫的毒力测定[J]. 中国蔬菜， 2011（14）：74-76.
[23]刘奎，唐良德，李鹏，等.几种杀虫剂对豆大蓟马的毒力测定及复配增效作用[J].热带作物学报，2014，35（8）：1615-1618.
[24]付步礼，唐良德，刘俊峰，等.乙基多杀菌素与4种杀虫剂复配对黄胸蓟马的联合毒力[J].植物保护，2016，42（4）：221-225.
[25]杨莹莹，赖晓伊， 赖多， 等. 氯虫苯甲酰胺与茚虫威对甜菜夜蛾的混配增效作用[J]. 广东化工， 2017（12）：58-59.
[26]张志祥， 程东美， 胡珊， 等. 以共毒系数评价农药联合作用的不合理性[J]. 植物保护， 2008， 34（1）：34-36.
[27]顾中言， 韩丽娟， 钟定亮， 等. 农药复配剂增效作用的定性定量分析[J]. 江苏农业科学， 1990（3）：31-34.
[28]常静，张薇，李海平，等.吡虫啉与三种拟除虫菊酯杀虫剂对马铃薯桃蚜的联合毒力[J].植物保护，2016，42（6）：225-228.
[29]付志能， 朱秀， 魏敬怀， 等. 阿维菌素与其他3种药剂复配对朱砂叶螨的联合作用[J]. 植物保护， 2015， 41（1）：196-200.
[30]赵平， 严秋旭， 李新， 等. 双酰胺类杀虫剂的现状与展望[J]. 农药科学与管理， 2015， 36（11）：41-45.
[31]杜军辉， 于伟丽， 王猛， 等. 三种双酰胺类杀虫剂对小地老虎和蚯蚓的选择毒性[J]. 植物保护学报， 2013， 40（3）：266-272.
[32]武海斌， 范昆， 张坤鹏， 等. 13种杀虫剂对小地老虎卵和幼虫的生物活性[J]. 环境昆虫学报， 2013， 35（3）：409-414.
[33]刘同金， 庄乾营， 赵维， 等. 氯虫苯甲酰胺防治玉米田小地老虎和玉米螟试验[J]. 山东农业科学， 2010（9）：81-82.
[34]陆俊姣， 董晋明， 赵荣华， 等. 4种药剂对小地老虎幼虫的毒力及田间防效[J]. 中国植保导刊， 2016（2）：60-62.
[35]胡珍娣，陈焕瑜，李振宇，等.华南小菜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺已产生严重抗性[J].广东农业科学，2012，39（1）：79-81.
[36]尹飞， 冯夏， 李振宇， 等. 不同地区小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗药性差异[J]. 植物保护， 2015，41（5）：160-163.
[37]LAI Tiancai， LI Jia， SU Jianya. Monitoring of beet armywormSpodoptera exigua， （Lepidoptera： Noctuidae） resistance to chlorantraniliprole in China [J].Pesticide Biochemistry
关键词 小地老虎； 农药复配； 共毒因子； 共毒系数
中图分类号： S 433.82
文献标识码： B
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017471
Abstract In order to screen out the combination of insecticide complex agents with synergistic effect onAgrotis ipsilon， the co-toxicity of chlorantraniliprole withlambda-cyhalothrin， thiamethoxam， chlorfenapyr， chlorpyrifos， emamectin benzoate and spinetoram against 3rd-instar ofAgrotis ipsilonwere determined with leaf dipping method， and the combined effects of the combinations were evaluated by the method of co-toxicity factor and co-toxicity coefficient in the laboratory. Sixteen combinations of the co-toxicity factor more than 20 and eighteen combinations of co-toxicity coefficient greater than 120 were screened qualitatively by co-toxicity factor method and co-toxicity coefficient method， respectively. The results showed that chlorantraniliprole withlambda-cyhalothrin， chlorfenapyr， chlorpyrifos， emamectin benzoate， spinetoram and thiamethoxam， with ratio of 6∶5， 1∶2， 1∶1， 3∶4， 3∶5， 3∶8，respectively， showed significant synergistic effect， and the co-toxicity coefficient （CTC） was 220.28， 214.15， 298.79， 171.85， 201.90 and 319.64， respectively.
Key words Agrotis ipsilon； combination of insecticides； co-toxicity factor； co-toxicity coefficient
小地老虎Agrotis ipsilon（Rottemberg） 屬鳞翅目夜蛾科，俗称土蚕、地剪、切根虫等，是一种多食性的世界性农业害虫，在我国各省份均有分布，其寄主十分广泛，主要为害玉米、蔬菜等100多种农作物[1]。长期以来，对该害虫的防治以化学药剂防治为主[2]。全球气候变暖和农业种植制度（免耕技术、轮作制度等）的改变为小地老虎提供了隐蔽的场所，加重了其为害程度，导致作物产量损失严重。而且小地老虎具有迁徙性强、抗药性发展快等特点，近年来该虫在我国发生为害日趋严重[3]。
氯虫苯甲酰胺是双酰胺类杀虫剂，由杜邦公司发现并开发，该药剂对鳞翅目害虫高效，对哺乳动物低毒，作用机制独特而与常规杀虫剂无交互抗性[4]。但广泛应用后害虫产生抗性风险也在逐步增加[5]，许多鳞翅目害虫已对其产生了严重的抗药性。国内外关于小地老虎生物学、生态学及防治药剂的报道有很多[6-11]，但有关其对药剂的抗性及其生化机制以及新药剂的开发等方面研究仍存在不足[12]。研究表明小地老虎对有机磷类、菊酯类等多种药剂已产生了很高的抗性，有些种类的杀虫剂对其甚至完全失效[13-16]。氯虫苯甲酰胺作为当前防治鳞翅目害虫的主要药剂，其长期大量施用必会加速小地老虎的抗药性发展，将对农作物的安全生产造成严重威胁。因此，研究农药复配制剂对于延长新农药品种使用寿命、缓解抗性产生、提高药效、扩大防治谱、保证环境安全和降低防治成本等具有重要的意义[17]。
为筛选出对小地老虎具有增效作用的复配药剂组合，并明确其在不同配比下的联合作用效果。本研究在测定氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、噻虫嗪、毒死蜱、虫螨腈、甲维盐、乙基多杀菌素对小地老虎3龄幼虫室内毒力的基础上，采用等效线法设置配比，并以共毒因子法进行定性筛选与共毒系数法进行定量分析相结合的方法筛选出具有增效活性的配方组合，明确其最佳复配比例及联合毒力效果，旨在为田间小地老虎的化学防治和抗性治理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 试验药剂及来源 供试杀虫剂均为原药，包括95.3%氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole），上海杜邦农化有限公司；96%高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothrin），山东潍坊润丰化工股份有限公司；98%噻虫嗪（thiamethoxam），浙江禾本科技有限公司；95%毒死蜱（chlorpyrifos），浙江新安化工集团股份有限公司；90%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（emamectin benzoate），后文简称甲维盐，南京红太阳股份有限公司；81.2%乙基多杀菌素（spinetoram），美国陶氏益农公司；95%虫螨腈（chlorfenapyr），德国拜耳作物科学公司；溶剂：99%丙酮（acetone），天津大茂化学试剂厂；乳化剂：TritonX-100，北京雅安达生物技术有限公司。
1.1.2 供试虫源
将田间诱集的小地老虎Agrotis ipsilon（Rottemberg）成虫，在室内条件下饲养至产卵，成虫喂食20%的蜂蜜水。初孵幼虫（1～2龄）喂食新鲜甘蓝叶片，3龄以后转入12孔细胞培养板（孔径22 mm，孔深18 mm），并喂食新鲜的人工饲料，老熟幼虫转入平底试管（直径22 mm，高80 mm）内饲养直至化蛹。试虫饲养条件：人工智能养虫室，温度为（27±1）℃、相对湿度为75%±5%、光周期为L∥D=16 h∥8 h、光照强度3 500 lx。选择同一批生长一致的新蜕皮（12 h内）3龄幼虫进行室内毒力测定。
1.2 试验方法
1.2.1 单剂毒力测定
室内毒力测定采用浸叶法。将供试药剂用丙酮配制成母液，再用0.05% 的TritonX-100水溶液将药剂等比稀释至试验浓度。将从未用药的鲜嫩甘蓝叶表面蜡质层洗去，晾干，用直径1.5 cm打孔器打成的小叶碟（避开主叶脉），将叶碟分别在不同处理药液中浸泡10 s，取出后在吸水纸上晾干（25℃，2 h），然后放入24孔细胞培养板（孔径16 mm，孔深17 mm）中，每孔放3片叶碟，每孔接入1头新蜕皮（12 h 内）的3龄幼虫，每个处理重复4 次，每个重复24 头试虫，以0.05% 的TritonX-100水溶液作对照。
将处理试虫置于温度（27±1）℃、相对湿度75%±5%、光周期L∥D=16 h∥8 h 的实验室条件下饲养观察，48 h后检查死亡虫数，用毛笔轻触无反应者视为死亡。根据试验要求和药剂特点，可以适当延长或缩短检查时间。
1.2.2 共毒因子的测定
采用Mansour等[18]的共毒因子法定性筛选出共毒因子大于20的增效配比。假设经毒力测定A、B两单剂的致死中浓度分别为a和b，选择具有增效作用的5个配比，这5个配比即为等效线法中相加作用线的六等分点，可表示为a/5b、a/2b、a/b、2a/b、5a/b。这5个配比混剂的浓度分别为（a 5b）/6、（a 2b）/3、（a b）/2、（2a b）/3、（5a b）/6，通過共毒因子法评价A B混剂的增效作用效果。具体配制方法是将各单剂配制成致死中浓度药液，再按体积比1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1混合即得不同配比混剂药液，用于初步评价氯虫苯甲酰胺与6种药剂按不同比例复配的联合作用。
共毒因子=（实测死亡率-理论死亡率）/理论死亡率×100，共毒因子>20表示有增效作用；-20≤共毒因子≤20表示相加作用；共毒因子<-20表示拮抗作用。生物测定方法同1.2.1。
1.2.3 共毒系数的测定
以共毒因子法筛选出共毒因子大于20的配比作参考，并在该配比范围内进一步细化配比，再根据死亡率设置5～7个浓度梯度测定其对小地老虎3龄幼虫的联合毒力，求出LC50及线性回归方程，通过参照Sun等[19]的共毒系数法计算出共毒系数（CTC），筛选出共毒系数大于120的最佳增效配比。
相对毒力指数（TI）=（标准药剂LC50/供试药剂LC50）×100；
混剂实际毒力指数（ATI）=（标准药剂LC50/供试药剂LC50）×100；
混剂理论毒力指数（TTI）=ATI（A）×药剂A在混剂中百分含量 ATI（B）×药剂B在混剂中的百分含量；
共毒系数（CTC）=（混剂实际毒性指数ATI/混剂理论毒性指数TTI）×100，大于120为增效作用；共毒系数80～120为相加作用；小于80为拮抗作用。计算共毒系数时使用复配组合中LC50较大的单剂为标准杀虫剂。生物测定方法同1.2.1。
1.3 数据处理
根据小地老虎的存活情况，不同药剂处理间的死亡率用Abbott’s公式校正，计算出死亡率，采用DPS 8.01软件和 Microsoft Excel 2010软件对数据进行统计分析，得出毒力回归方程、致死中浓度LC50、95%置信区间（95%CI）、相关系数r、相对毒力指数（TI）及相关参数。
2 结果与分析
2.1 单剂毒力测定结果
7种杀虫剂对小地老虎3龄幼虫毒力测定结果（表1）表明，氯虫苯甲酰胺的毒力最高，其LC50为2.725 6 mg/L，噻虫嗪的毒力最低，其LC50为37.582 6 mg/L，毒力大小顺序为：氯虫苯甲酰胺>高效氯氟氰菊酯>虫螨腈>毒死蜱>甲维盐>乙基多杀菌素>噻虫嗪。
2.2 共毒因子法定性筛选结果
采用共毒因子法测定氯虫苯甲酰胺与6种药剂按不同比例复配对小地老虎3龄幼虫的毒力（表2）。在试验的6个复配组合中，共毒因子大于20的组合共有16组，其中与高效氯氟氰菊酯3∶10、3∶5、6∶5复配时共毒因子分别为37.89、30.67、40.17；与虫螨腈1∶8、1∶2复配时共毒因子分别为41.83、45.59；与毒死蜱1∶25、1∶10、1∶5、2∶5、1∶1复配时的共毒因子分别为30.97、27.65、26.96、33.55、38.45；与甲维盐3∶40、3∶10、3∶4复配时共毒因子分别为31.61、25.90、38.37；与乙基多杀菌素3∶5复配时共毒因子为31.54；与噻虫嗪3∶20、3∶8复配时共毒因子分别为27.29、41.69。 2.3 共毒系数法定量筛选结果
在共毒因子法定性最佳配比组合筛选的基础上，进一步通过共毒系数法测定不同配比组合的增效作用。由共毒系数法定量筛选的结果（表3）可知，在所设配比中，氯虫苯甲酰胺与高效氯氟氰菊酯1∶4、3∶10、6∶5复配时共毒系数分别为133.21、207.54、220.28，其中以6∶5复配时增效作用最显著，配比3∶5表现为相加作用，配比2∶1为拮抗作用；与虫螨腈1∶9、1∶8、1∶2、1∶1复配时共毒系数分别为123.54、164.92、214.15、125.46，以1∶2复配时增效最显著，1∶5为拮抗作用；与毒死蜱1∶25、1∶10、2∶5、1∶1复配时共毒系数分别为158.18、125.88、204.79、298.79，以1∶1复配增效最显著，1∶5为拮抗作用；与甲维盐3∶40、3∶4复配时共毒系数分别为156.12、171.85，以3∶4复配增效最显著，1∶2为拮抗作用；与乙基多杀菌素3∶5、3∶4复配时共毒系数分别为201.90、125.20，以3∶5复配增效最显著，1∶1为拮抗作用；与噻虫嗪3∶20、3∶8、1∶2复配时共毒系数分别为147.20、319.64、196.54，以3∶8复配增效最显著，1∶5为拮抗作用。氯虫苯甲酰胺与6种不同类别药剂复配时均有增效作用的组合，其中有部分共毒因子大于20的组合的共毒系数小于120，即共毒因子大于20的复配组合不一定具有增效作用。
3 结论与讨论
国内常用的农药混用联合作用评价方法有很多，其中孙云沛的共毒系数法是农药联合作用的主要评价方法之一[20]，该方法不仅可以知道混剂是否增效，同时还可知道混剂的增效程度。很多研究采用共毒系数法评价几种药剂复配对靶标昆虫的联合毒力[21-25]，然而，该方法工作量大，所需靶标昆虫虫量大，且测定结果有一部分组合无增效作用，难以得到最佳的配比，已不适于评价农药的联合作用，其评价结果难以指导农药的实际生产和应用[26]。而共毒因子法具有省时、省工、省材料等特点，此法只能确定每个复配组合是否增效，但不可能知道复配剂对靶标昆虫的实际毒力和增效程度[27]。现常用共毒因子与共毒系数相结合的方法评价农药的联合作用，该方法通过共毒因子法对大量的配比进行定性筛选，再用共毒系数法对共毒因子大于20的配比组合进行定量筛选，得到具有增效作用的最佳配比和各配比的增效程度。但也有结果表明，通过共毒因子法得到共毒因子大于20的增效组合后，再用共毒系数法对共毒因子大于20复配组合筛选时却没有增效作用[28-29]。本研究也出现了这种情况。
双酰胺类杀虫剂由于低毒、靶标独特、应用方法多样，已成为害虫综合治理战略中的一类重要药剂[30]。氯虫苯甲酰胺对鳞翅目害虫幼虫毒力明显高于高效氯氰菊酯、噻虫嗪、阿维菌素、乙基多杀菌素、茚虫威等药剂，且对非靶标生物表现出了很强的毒力选择性[12，31-32]，刘同金等[33]和陆俊姣等[34]发现氯虫苯甲酰胺对玉米田小地老虎的田间防治效果达到90%以上，表明氯虫苯甲酰胺是防治小地老虎等鳞翅目害虫最为高效的药剂之一。但由于杀虫剂频繁施用，小地老虎的抗药性发展十分迅速，现已对有机磷类和拟除虫菊酯类等多种杀虫剂产生了很高的抗药性，有些种类的杀虫剂甚至完全失效[15]。随着氯虫苯甲酰胺田间的大量使用，研究发现部分地区小菜蛾Plutella xylostella（L.）、甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）和斜纹夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）等鳞翅目害虫已对其产生了不同程度的抗药性[35-37]。如果在小地老虎的防治上不加节制地频繁使用氯虫苯甲酰胺，也会加速其抗药性的发展。因此，加快新农药品种的开发和对现有杀虫剂进行科学合理混配已成为抗药性治理和害虫综合防治的有效手段。
本研究以氯虫苯甲酰胺为主干药剂，分别与其他6种不同类别杀虫剂进行复配，通过等效线法选择具有增效作用的5个配比，采用共毒因子法筛选出共毒因子大于20的复配组合，然后进一步细化配比，通过共毒系数法筛选出共毒系数大于120的最佳复配组合。研究结果将为防治小地老虎复配剂配方的筛选和抗性治理提供理论基础和技术支持，有关氯虫苯甲酰胺与几种药剂复配对小地老虎的增效作用机理及增效配方在实际生产中的应用效果，有待进一步试验验证。
参考文献
[1] 魏鸿钧， 张昭良， 王荫长. 中国地下害虫[M]. 上海：上海科学技术出版社， 1989：273-376.
[2] NAGATA T. Insecticide resistance and chemical control of the brown planthopper，Nilaparvata lugensStl （Homoptera： Delphacidae）[J]. Bulletin of the Kyushu Agricultural Experiment Station， 1982， 22（1）：49-164.
[3] 向玉勇，楊茂发，李子忠.小地老虎室内连续饲养12代的化蛹率、羽化率和性比观察[J].黄山学院学报，2010，12（5）：67-69.
[4] 徐尚成， 俞幼芬， 王晓军， 等. 新杀虫剂氯虫苯甲酰胺及其研究开发进展[J]. 现代农药， 2008， 7（5）：8-11.
[5] 冯聪， 宋玉泉， 班兰凤. 鱼尼汀受体类杀虫剂抗药性研究进展[J]. 农药， 2014， 53（7）：469-481.
[6] RINGS R W， ARNOLD F J， KEASTER A J， et al. A worldwide， annotated bibliography of the black cutworm，Agrotis ipsilon （Hüfnagel）[M]. Ohio： Ohio Agricultural Research and Development Center， 1974：1-106. [7] 陈国生. 六索线虫防治小地老虎的小区试验[J]. 生物防治通报， 1989， 5（3）：125-126.
[8] 李永禧.小地老虎生活习性及防治[J].昆虫知识，1964（1）：1-5.
[9] 韩召军. 小地老虎对几类杀虫剂的毒力反应及其抗药性变化[J]. 植物保护学报， 1986，13（2）：125-130.
[10]COSSENTINE J E. The experimental evolution on application microspondia against Agrotis ipsilon（Rottemberg）[J]. Entomophaga， 1987， 31（4）：323-330.
[11]SALAMA H S.Strengthen control result of Bt againstAgrotis ipsilon（Rottemberg）[J]. Journal of Applied Entomology， 1989， 108（4）：372-380.
[12]于伟丽. 防治小地老虎高效药剂筛选及对土壤生物安全性评价[D]. 泰安：山东农业大学， 2012.
[13]唐振華. 我国农业害虫抗药性及其对策[J]. 植物保护， 1983， 9（1）：22-24.
[14]龚坤元.害虫的抗药性[J].昆虫知识，1982（1）：43-46.
[15]向玉勇，杨茂发. 小地老虎在我国的发生危害及防治技术研究[J]. 安徽农业科学， 2008， 36（33）：14636-14639.
[16]储志坚， 汪济民， 孙卫东， 等. 乐斯本15%颗粒剂防治菊花地下害虫药效试验[J]. 安徽农学通报， 2007（4）：200.
[17]金剑雪， 金道超， 李文红， 等. 防治白背飞虱的农药复配增效配方筛选[J]. 植物保护， 2017， 43（1）：199-204.
[18]MANSOUR N A，ELDEFRAWI M E，TOPPOZADA A， et al. Toxicological studies on the egyptian cotton leaf worm，Prodenia litura. Ⅵ.Potentiation and antagonism of organophosphorus and carbamate insecticides [J].Journal of Economic Entomology，1966，59（2）：307-311.
[19]SUN Yunpei， Johnson E R.Analysis of joint action of insecticides against house flies [J]. Journal of Economic Entomology， 1960， 53（5）：887-892.
[20]陈立， 徐汉虹， 李云宇， 等. 农药复配最佳增效配方筛选方法的探讨[J]. 植物保护学报， 2000， 27（4）：349-354.
[21]乔康， 王开运， 石绪根. 几种杀虫剂及其混剂对褐飞虱的毒力测定[J]. 农药研究与应用， 2010（2）：19-21.
[22]刘奎， 付步礼， 邱海燕， 等. 几种杀虫剂及其混配对瓜实蝇成虫的毒力测定[J]. 中国蔬菜， 2011（14）：74-76.
[23]刘奎，唐良德，李鹏，等.几种杀虫剂对豆大蓟马的毒力测定及复配增效作用[J].热带作物学报，2014，35（8）：1615-1618.
[24]付步礼，唐良德，刘俊峰，等.乙基多杀菌素与4种杀虫剂复配对黄胸蓟马的联合毒力[J].植物保护，2016，42（4）：221-225.
[25]杨莹莹，赖晓伊， 赖多， 等. 氯虫苯甲酰胺与茚虫威对甜菜夜蛾的混配增效作用[J]. 广东化工， 2017（12）：58-59.
[26]张志祥， 程东美， 胡珊， 等. 以共毒系数评价农药联合作用的不合理性[J]. 植物保护， 2008， 34（1）：34-36.
[27]顾中言， 韩丽娟， 钟定亮， 等. 农药复配剂增效作用的定性定量分析[J]. 江苏农业科学， 1990（3）：31-34.
[28]常静，张薇，李海平，等.吡虫啉与三种拟除虫菊酯杀虫剂对马铃薯桃蚜的联合毒力[J].植物保护，2016，42（6）：225-228.
[29]付志能， 朱秀， 魏敬怀， 等. 阿维菌素与其他3种药剂复配对朱砂叶螨的联合作用[J]. 植物保护， 2015， 41（1）：196-200.
[30]赵平， 严秋旭， 李新， 等. 双酰胺类杀虫剂的现状与展望[J]. 农药科学与管理， 2015， 36（11）：41-45.
[31]杜军辉， 于伟丽， 王猛， 等. 三种双酰胺类杀虫剂对小地老虎和蚯蚓的选择毒性[J]. 植物保护学报， 2013， 40（3）：266-272.
[32]武海斌， 范昆， 张坤鹏， 等. 13种杀虫剂对小地老虎卵和幼虫的生物活性[J]. 环境昆虫学报， 2013， 35（3）：409-414.
[33]刘同金， 庄乾营， 赵维， 等. 氯虫苯甲酰胺防治玉米田小地老虎和玉米螟试验[J]. 山东农业科学， 2010（9）：81-82.
[34]陆俊姣， 董晋明， 赵荣华， 等. 4种药剂对小地老虎幼虫的毒力及田间防效[J]. 中国植保导刊， 2016（2）：60-62.
[35]胡珍娣，陈焕瑜，李振宇，等.华南小菜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺已产生严重抗性[J].广东农业科学，2012，39（1）：79-81.
[36]尹飞， 冯夏， 李振宇， 等. 不同地区小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗药性差异[J]. 植物保护， 2015，41（5）：160-163.
[37]LAI Tiancai， LI Jia， SU Jianya. Monitoring of beet armywormSpodoptera exigua， （Lepidoptera： Noctuidae） resistance to chlorantraniliprole in China [J].Pesticide Biochemistry