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摘要
为明确辽宁省不同地区间番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性是否存在差异，以及咯菌腈与其他杀菌剂之间是否存在交互抗性，采用菌丝生长速率法测定番茄灰霉病菌对咯菌腈、腐霉利、多菌灵的敏感性。结果表明，从辽宁省6个不同地区分离的番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的平均EC50差异不显著，番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的敏感性频率呈正态分布，咯菌腈对不同地区共117株番茄灰霉病菌的EC50平均值为（0.007 3±0.004 5）μg/mL，且咯菌腈与腐霉利和多菌灵之间均不存在交互抗药性。
关键词
番茄灰霉病菌； 咯菌腈； 敏感基线； 交互抗性
番茄灰霉病是由半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）引起的一种世界性重要病害[1]，自20世纪80年代开始在我国出现，现已成为番茄生产中的限制性障碍[2]。目前生产上该病的防治以化学防治为主[35]，常用的杀菌剂有苯并咪唑类的多菌灵、二甲酰亚胺类的腐霉利、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺等。然而番茄灰霉病菌对常用化学杀菌剂的抗性问题已十分突出[610]。据报道，新型杀菌剂咯菌腈对番茄灰霉病菌具有很高的抑制活性[1112]，目前，番茄灰霉病菌对该药的抗性在辽宁省还没有普遍发生。辽宁省不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈敏感性研究还未见报道，本文检测了辽宁省6个地区的番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性，并对其进行了比较分析，研究了咯菌腈与其他防治番茄灰霉病菌的杀菌剂之间是否存在交互抗性，旨在为今后辽宁省各地区番茄灰霉病菌的抗药性监测和治理对策的制定提供参考，同时为咯菌腈在辽宁省多地区的使用提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株
2014年从辽宁省的沈阳市、抚顺市、普兰店市、海城市、北票市、辽中县采集感染番茄灰霉病的病果和病叶，每个大棚采集4～6个病果或病叶放于自封袋中带回实验室。在无菌条件下，经过分离纯化共得到117株番茄灰霉病菌，移接到PDA斜面上，于4℃的冰箱内保存备用。
1.1.2 供试药剂
98%咯菌腈（fludioxonil）原药，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供；99%腐霉利（procymidone）原药，连云港优士化学品有限公司提供；50%多菌灵（carbendazim）可湿性粉剂，安徽华星化工有限公司提供。
1.1.3 供试培养基
PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，15～20 g琼脂条加水至1 000 mL，于121℃的高压蒸汽灭菌锅内湿热灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 辽宁省不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性测定及比较
采用菌丝生长速率法[13]。在无菌条件下，将亲本菌株接种于PDA平板上，于25℃恒温培养箱中培养3 d，用打孔器沿菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，菌丝面向下接种于含系列质量浓度（0、0.000 8、0.004、0.02、0.1、0.5 μg/mL）咯菌腈的PDA含药平板中央。每个处理3次重复，于25℃恒温培养箱中培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，利用DPS软件统计不同浓度咯菌腈对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率，以药剂浓度的对数值为横坐标（x），抑制率的几率值为纵坐标（y），求出毒力回归方程y=a bx，有效中浓度（EC50）和相关系数（r）。将咯菌腈对不同地区供试菌株的EC50进行整理，采用SPSS软件对不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈敏感性进行差异性分析。
1.2.2 咯菌腈与不同作用机制杀菌剂的交互抗药性研究
采用菌丝生长速率法测定不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈、腐霉利、多菌灵的敏感性。使用SPSS软件分析咯菌腈对所有供试菌株的EC50的对数值与腐霉利、多菌灵对供试菌株的EC50的对数值之间的相关性，确定咯菌腈与腐霉利、多菌灵之间是否存在交互抗药性。
2 结果与分析
2.1 辽宁省不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性
采用菌丝生长速率法测定了从辽宁省不同地区分离纯化的117株番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性。由表1看出，咯菌腈对不同地区番茄灰霉病菌的EC50为0.000 7～0.024 4 μg/mL，平均值为0.007 3 μg/mL，最大值和最小值相差34.86倍，各地区番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的平均EC50没有显著差异。
采用SPSS软件对不同地区的EC50均值进行单因素方差分析。Tukey’s Multiple对比试验分析方差，得P=0.384 >0.05，故咯菌腈对不同地区间番茄灰霉病菌的EC50差异不显著。
2.2 番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性基线的建立
由图1看出供试的番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的敏感性呈连续性分布。利用SPSS软件进行KS法非参数性检验，得P=0.089。因P>0.05，供试的117株番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性频率符合正态分布。各地区间可建立番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感基线[1415]。在番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性范围内，以EC50为依据，从0 μg/mL开始，以0.003 μg/mL为截距，将EC50等分为8个阶段，以每个阶段EC50的范围为横坐标，敏感性发生频率为纵坐标，制作番茄灰霉病菌菌株敏感性频率分布图（图2）。
由图2可看出，供试的117株番茄灰霉病菌中，EC50在0.003 5～0.006 5 μg/mL的菌株出现频率最高，为35%，其他区间频率依次降低。
2.3 咯菌腈与腐霉利和多菌灵之间的交互抗性
咯菌腈对不同菌株EC50对数值与腐霉利、多菌灵对相应菌株的EC50对数值之间的相关系数分别为0.106 （P=0.658）和-0.183（P=0.439），均未达到显著水平，表明咯菌腈与腐霉利、多菌灵之间均不存在交互抗药性（图3～4）。
3 结论与讨论
试验得出辽宁省不同地区番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的敏感性差异不显著，可能与这些地区对新型药剂咯菌腈的施药频率和使用年限等因素有关。各地区没有发现对咯菌腈有抗性的菌株，该结果可为今后咯菌腈在辽宁省的使用提供重要依据。将平均EC50（0.007 3±0.004 5）μg/mL定为辽宁省番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性基线。该基线可为今后监测番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗性状况提供参考。
本文结果表明，咯菌腈与腐霉利、多菌灵之间不存在交互抗药性。咯菌腈对番茄灰霉病菌的作用机制独特，对于已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N苯氧基甲酸酯类等杀菌剂产生抗性的灰霉病菌仍然具有很高的毒力[1617]，可用于番茄灰霉病的防治，但在生产中应与不同作用机制的杀菌剂交替使用，来延缓番茄灰霉病菌对咯菌腈抗性的产生。
参考文献
[1] 康立娟，张小风，王文桥，等.灰霉菌的抗药性与适合度测定[J].农药学学报，2000，2（3）：3942.
[2] 李宝聚.温室番茄灰霉病流行规律研究[M]//冯兰香，杨又迪.中国番茄病虫害及其防治技术研究，北京：中国农业出版社，1999：3135.
[3] 尹元拴，张治家，张琦.番茄灰霉病田间药效试验[J].山西农业科学，2005，33（4）：6970.
[4] 张智，李君明，宋燕，等.番茄灰霉病及其防治研究进展[J].内蒙古农业大学学报（自然科学版），2005，26（2）：125128.
[5] 王勇，郝永娟，刘春艳，等.几种杀菌剂防治番茄灰霉病的药效评价[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（S1）：9597.
[6] 纪明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性[J].植物保护学报，2003，30（4）：396400.
[7] 丁中，刘峰，王会利，等.番茄灰霉菌的多重抗药性研究[J].山东农业大学学报（自然科学版），2001，32（4）：452456.
为明确辽宁省不同地区间番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性是否存在差异，以及咯菌腈与其他杀菌剂之间是否存在交互抗性，采用菌丝生长速率法测定番茄灰霉病菌对咯菌腈、腐霉利、多菌灵的敏感性。结果表明，从辽宁省6个不同地区分离的番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的平均EC50差异不显著，番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的敏感性频率呈正态分布，咯菌腈对不同地区共117株番茄灰霉病菌的EC50平均值为（0.007 3±0.004 5）μg/mL，且咯菌腈与腐霉利和多菌灵之间均不存在交互抗药性。
关键词
番茄灰霉病菌； 咯菌腈； 敏感基线； 交互抗性
番茄灰霉病是由半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）引起的一种世界性重要病害[1]，自20世纪80年代开始在我国出现，现已成为番茄生产中的限制性障碍[2]。目前生产上该病的防治以化学防治为主[35]，常用的杀菌剂有苯并咪唑类的多菌灵、二甲酰亚胺类的腐霉利、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺等。然而番茄灰霉病菌对常用化学杀菌剂的抗性问题已十分突出[610]。据报道，新型杀菌剂咯菌腈对番茄灰霉病菌具有很高的抑制活性[1112]，目前，番茄灰霉病菌对该药的抗性在辽宁省还没有普遍发生。辽宁省不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈敏感性研究还未见报道，本文检测了辽宁省6个地区的番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性，并对其进行了比较分析，研究了咯菌腈与其他防治番茄灰霉病菌的杀菌剂之间是否存在交互抗性，旨在为今后辽宁省各地区番茄灰霉病菌的抗药性监测和治理对策的制定提供参考，同时为咯菌腈在辽宁省多地区的使用提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株
2014年从辽宁省的沈阳市、抚顺市、普兰店市、海城市、北票市、辽中县采集感染番茄灰霉病的病果和病叶，每个大棚采集4～6个病果或病叶放于自封袋中带回实验室。在无菌条件下，经过分离纯化共得到117株番茄灰霉病菌，移接到PDA斜面上，于4℃的冰箱内保存备用。
1.1.2 供试药剂
98%咯菌腈（fludioxonil）原药，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供；99%腐霉利（procymidone）原药，连云港优士化学品有限公司提供；50%多菌灵（carbendazim）可湿性粉剂，安徽华星化工有限公司提供。
1.1.3 供试培养基
PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，15～20 g琼脂条加水至1 000 mL，于121℃的高压蒸汽灭菌锅内湿热灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 辽宁省不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性测定及比较
采用菌丝生长速率法[13]。在无菌条件下，将亲本菌株接种于PDA平板上，于25℃恒温培养箱中培养3 d，用打孔器沿菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，菌丝面向下接种于含系列质量浓度（0、0.000 8、0.004、0.02、0.1、0.5 μg/mL）咯菌腈的PDA含药平板中央。每个处理3次重复，于25℃恒温培养箱中培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，利用DPS软件统计不同浓度咯菌腈对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率，以药剂浓度的对数值为横坐标（x），抑制率的几率值为纵坐标（y），求出毒力回归方程y=a bx，有效中浓度（EC50）和相关系数（r）。将咯菌腈对不同地区供试菌株的EC50进行整理，采用SPSS软件对不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈敏感性进行差异性分析。
1.2.2 咯菌腈与不同作用机制杀菌剂的交互抗药性研究
采用菌丝生长速率法测定不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈、腐霉利、多菌灵的敏感性。使用SPSS软件分析咯菌腈对所有供试菌株的EC50的对数值与腐霉利、多菌灵对供试菌株的EC50的对数值之间的相关性，确定咯菌腈与腐霉利、多菌灵之间是否存在交互抗药性。
2 结果与分析
2.1 辽宁省不同地区番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性
采用菌丝生长速率法测定了从辽宁省不同地区分离纯化的117株番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性。由表1看出，咯菌腈对不同地区番茄灰霉病菌的EC50为0.000 7～0.024 4 μg/mL，平均值为0.007 3 μg/mL，最大值和最小值相差34.86倍，各地区番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的平均EC50没有显著差异。
采用SPSS软件对不同地区的EC50均值进行单因素方差分析。Tukey’s Multiple对比试验分析方差，得P=0.384 >0.05，故咯菌腈对不同地区间番茄灰霉病菌的EC50差异不显著。
2.2 番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性基线的建立
由图1看出供试的番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的敏感性呈连续性分布。利用SPSS软件进行KS法非参数性检验，得P=0.089。因P>0.05，供试的117株番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性频率符合正态分布。各地区间可建立番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感基线[1415]。在番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性范围内，以EC50为依据，从0 μg/mL开始，以0.003 μg/mL为截距，将EC50等分为8个阶段，以每个阶段EC50的范围为横坐标，敏感性发生频率为纵坐标，制作番茄灰霉病菌菌株敏感性频率分布图（图2）。
由图2可看出，供试的117株番茄灰霉病菌中，EC50在0.003 5～0.006 5 μg/mL的菌株出现频率最高，为35%，其他区间频率依次降低。
2.3 咯菌腈与腐霉利和多菌灵之间的交互抗性
咯菌腈对不同菌株EC50对数值与腐霉利、多菌灵对相应菌株的EC50对数值之间的相关系数分别为0.106 （P=0.658）和-0.183（P=0.439），均未达到显著水平，表明咯菌腈与腐霉利、多菌灵之间均不存在交互抗药性（图3～4）。
3 结论与讨论
试验得出辽宁省不同地区番茄灰霉病菌菌株对咯菌腈的敏感性差异不显著，可能与这些地区对新型药剂咯菌腈的施药频率和使用年限等因素有关。各地区没有发现对咯菌腈有抗性的菌株，该结果可为今后咯菌腈在辽宁省的使用提供重要依据。将平均EC50（0.007 3±0.004 5）μg/mL定为辽宁省番茄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性基线。该基线可为今后监测番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗性状况提供参考。
本文结果表明，咯菌腈与腐霉利、多菌灵之间不存在交互抗药性。咯菌腈对番茄灰霉病菌的作用机制独特，对于已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N苯氧基甲酸酯类等杀菌剂产生抗性的灰霉病菌仍然具有很高的毒力[1617]，可用于番茄灰霉病的防治，但在生产中应与不同作用机制的杀菌剂交替使用，来延缓番茄灰霉病菌对咯菌腈抗性的产生。
参考文献
[1] 康立娟，张小风，王文桥，等.灰霉菌的抗药性与适合度测定[J].农药学学报，2000，2（3）：3942.
[2] 李宝聚.温室番茄灰霉病流行规律研究[M]//冯兰香，杨又迪.中国番茄病虫害及其防治技术研究，北京：中国农业出版社，1999：3135.
[3] 尹元拴，张治家，张琦.番茄灰霉病田间药效试验[J].山西农业科学，2005，33（4）：6970.
[4] 张智，李君明，宋燕，等.番茄灰霉病及其防治研究进展[J].内蒙古农业大学学报（自然科学版），2005，26（2）：125128.
[5] 王勇，郝永娟，刘春艳，等.几种杀菌剂防治番茄灰霉病的药效评价[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（S1）：9597.
[6] 纪明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性[J].植物保护学报，2003，30（4）：396400.
[7] 丁中，刘峰，王会利，等.番茄灰霉菌的多重抗药性研究[J].山东农业大学学报（自然科学版），2001，32（4）：452456.