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摘要：目的：建立利用UPLC同时测定复方丹参片中4种活性成分含量的方法。
方法：采用ACQUITY UPLC BEH C-18色谱柱；乙腈（A）-水（B）为流动相二元梯度洗脱，检测波长203nm，柱温30℃，流速0.2ml/min，测定同一厂家10批样品以及市售10厂家样品中4种皂苷的含量。
结果：4种活性成分在所建浓度范围内线性关系良好，r均大于0.999。
结论：所建立的UPLC方法可快速、简单地对复方丹参片中4种活性成分进行含量测定。
关键词：UPLC 复方丹参片 三七
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）04-0006-02
复方丹参片由丹参、三七、冰片三味药组成，具有活血化瘀、理气止痛之功效，临床上常用于治疗冠心病、高血压、心绞痛等病。三七为方中主要药物，其味苦、甘，性温，具有活血祛癖，通络止痛的作用。现代药理研究表明三七中所含活性成分主要是皂苷类，其中以人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的含量最高。国内外参考文献中有大量关于复方丹参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定的报导很多，但用UPLC法同时测定几种成分含量的研究少有报导[1-13]。本文利用UPLC法建立了一种同时测定复方丹参片中4种成分含量的方法，并经过验证，认为该方法有效、可行，可作为其质量控制的方法进行推广应用。
1 材料与试剂
1.1 实验材料。样品分别采集于广东省及广西省，具体来源及批号见表1。
1.2 仪器与试药。Waters超高效液相色谱仪，带有二元高压梯度泵、样品处理器、柱温箱、PDA检测器（厂家）；色谱柱ACQUITY UPLC BEH C-18柱（1.7μm，2.1×50mm）；超声清洗器（频率40KHz，功率 300W）（厂家）；CP 224s 型电子分析天平（德国赛多利斯sartorius Sartorius）；Milli-Q纯水处理系统（美国MILLIPO公司）；甲醇（分析纯，乙腈（色谱纯）。三七皂苷R1对照品（110745-200414）、人参皂苷Rg1对照品（110703-201027）、人参皂苷Re对照品（110754-200822）、人参皂苷Rb1对照品（110704-201122）均购自中国食品药品检验所。
2 方法与结果
2.1 样品溶液和对照品溶液的制备。
2.1.1 供试品溶液的制备：取样品10片，除去包衣，精密称重，计算平均片重，研成细粉混匀，精密称取0.5g，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液20ml，称定重量，超声（频率40kHz，功率300W）处理60min，放冷，70%甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，0.45μm滤膜过滤，为供试品溶液[14]。
2.1.2 对照品溶液的制备：配制方法酮“2.4.1”项中，各对照品溶液的第3浓度级别溶液，混合对照品溶液各成分浓度为：三七皂苷R1 83.6μg/ml、人参皂苷Rg1 249.36μg/ml、人参皂苷Re 246μg/ml、人参皂苷Rb1 43.68μg/ml。
2.1.3 空白对照溶液的制备：按处方比例不加三七，制得阴性对照品，按供试品液的制备方法制得阴性对照品溶液。
2.2 色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C-18（1.7μm 2.1*50mm）；柱温为30℃；流速0.200ml/min，进样量2μl，检测波长为203nm流动相采用乙腈（A）-水（B）（V/V）二元梯度系统进行梯度洗脱，线性洗脱梯度为：0～8min时19%A，8～
12min时19%～29%A，12～15min时29%A，15～18min时29%～40%A。
2.3 含量测定方法，精密吸取上述溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。
结果阴性对照品溶液的色谱图中在三七皂苷保留时间处无吸收峰，阴性无干扰。
2.4 标准曲线的绘制。
2.4.1 标准贮备液配制。精密称定各对照品适量，置量瓶中，分别用70%甲醇配制成三七皂苷R1（418μg/ml）、人参皂苷Rg1（415.6μg/ml）、Re（436.8μg/ml）、Rb1（410μg/ml）对照品溶液母液，分别精密量取各对照品母液适量，稀释成5个不同浓度级别的对照品溶液，各级别对照品溶液浓度见表2。
2.4.2 线性关系考查。取上述对照品溶液，进样测定，以峰面积A为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1在各自的线性范围内呈良好的线性关系。各对照品的回归方程、相关系数线性范围以及检测线结果见表3。
2.4.3 方法学考查。
2.4.3.1 精密度试验。取同一个供试品溶液（2121123批次，厂家10），按2.3项下重复进样6次，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，RSD结果见表4。
2.4.3.2 重复性试验 取同一批（2121123批次，厂家10）样品6份，按“2.1.1”项下样品溶液制备方法进行操作，在色谱条件下进样，测得各皂苷的含量，测得平均含量为三七皂苷R1含量0.8688mg/片、人参皂苷Rg1含量3.2526mg/片、人参皂苷Re含量0.3313mg/片、人参皂苷Rb1含量2.5243mg/片。RSD结果见表4。
2.4.3.3 稳定性试验 精密吸取同一批（2121123批次，厂家10）样品溶液，分别在0、1、2、4、6、12、24、36h时在色谱条件下测定，结果表明，供试品溶液在36h内基本稳定。RSD结果见表4。
2.4.3.4 加样回收试验。分别精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品8.36mg、27.56mg、2.81mg、21.23mg，置200ml量瓶中，加70%甲醇至刻度线，配成加样回收用混合对照品溶液。 取已知含量（2121123批次，厂家10；三七皂苷R1含量0.8679mg/片、人参皂苷Rg1含量3.2553mg/片、人参皂苷Re含量0.3341mg/片、人参皂苷Rb1含量2.5228mg/片）的样品0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入加样回收用混合对照品溶液20ml（相当于三七皂苷R1 0.8360mg、人参皂苷Rg1 2.7560mg、人参皂苷Re 0.2810mg、人参皂苷Rb1 2.1230mg），按含量测定方法操作，计算回收率。各皂苷的回收率、RSD结果见表5。
2.5 样品测定。分别取对照品溶液和供试品溶液，进样测定，以外标法用峰面积进行计算4种皂苷的含量。广州某厂家10批样品皂苷类含量结果见表6，市售来自于10个厂家的复方丹参片样品中皂苷类含量结果见表7。
3 讨论
3.1 2010版《中国药典》第一增补本中增加了复方丹参片三七含量的HPLC控制标准，规定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的总量计，不得少于6.0mg/片{规格（1）和规格（3）}。由图1可知，4种成分得到了较好分离，可以对4个成分进行含量测定。参考2010版《中国药典》第一增补本中三七含量控制标准，由表6知某厂家10批复方丹参片中4种皂苷总含量均高于6.0mg/片；市售10个厂家生产的复方丹参片，有两家的未检测到4种皂苷成分，只有一家生产的复方丹参片中4种皂苷总含量高于6.0mg/片，其余几家均低于6.0mg/片。因2010版《中国药典》第一增补本中三七含量控制方法为HPLC法，而本实验中使用的是UPLC法，不同于药典控制方法，所以不能因市售9厂家的测定结果低于6.0mg/片，就判定为不合格。分析市售9厂家4种皂苷总含量低的原因可能是：①样品量少，取样不够全面；②购买样品多为2011年生产，药品放置时间久，导致成分含量降低；③不排除有些厂家未使用合格的三七药材；④生产过程中的工艺参数设置差异，导致检测结果的不同；⑤所购买药品均是在2010版《中国药典》第一增补本施行之前生产并上市出售，厂家可能未严格控制三七药材的质量。
3.2 本研究中，UPLC法仅需18min即将待测成分完全分离，相比于HPLC法需75min内才能将待测成分完全分离，大大缩短了分析时间，提高了分离效率，实现了对复杂物质进行快速分离；并且该方法的精密度、重现性、稳定性、加样回收结果良好。UPLC法使用较少量的流动相，即可达到高效、快速分离的优点，使该方法即可以作为复方丹参片中皂苷成分含量测定方法，又可以在制剂工艺过程中实现对制剂中间提取物进行快速有效分析，从而控制药品质量。
参考文献
[1] Novakova L，Matyseva L，Solich P.Advantages of application of UPLC in pharmaceutical analysis.Talanta，2006，68：908-918
[2] 杨立伟，郑传奇，蒋忠军，等.超高效液相色谱法测定西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量[J].中药材，2008，31（1）：55-57
[3] 覃莎，王锦，徐远金.超高效液相色谱-串联质谱同时测定加味左金丸中的9种有效成分[J].色谱，2012，30（11）：1153-1158
[4] 王菲，李彤，马辰.超高效液相色谱-串联质谱测定中药材中三唑类杀菌剂及三嗪类除草剂的残留量.色谱，2013，31（3）：191-199
[5] 郑文红，蓝义琨.UPLC测定化瘀止痛片人参皂苷Rg1和三七皂苷R1含量实验报告.中国中医药，2012，10（3）：139-140
[6] 张勇，张玲，谢晓梅.一测多评法同时测定木瓜中2种常见三萜酸.中成药，2013，35（4）：770-773
[7] Rhourri-Frih B，Chaimbault P，Dequeral D，et al.Investigation of porous graphic carbon for triterpenoids and natural resinous materials analysis by high performance liquid chromatography hyphenated to mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2012，1240：140-146
[8] 张勇，周安，谢晓梅.聚合物键合ODS液相色谱-质谱联用法分析大枣中三萜酸含量.中国中药杂志，2013，38（6）：848-851
[9] 王文琼.超高液相在药物分析领域中的应用.中国医药导报，2012，9（11）：13-14
[10] 毕晓黎，罗文汇，胥爱丽，等.超高效液相色谱法测定白芷配方颗粒中欧前胡素和异欧前胡素的含量.中国实验方剂学，2012，18（10）：140-143
[11] Marie-Josée Rocheleaut，Elaine Larouche，Cristina Salamu，et al.Impurity profiling and in-process testing of drugs for injection by fast liquid chromatography.Journal of Pharmaceutical Analysis，2012，2（5）：372-377
[12] Shaligram S.Rane，Aikesh Ajamerib，Rustom Modyb，et al.Development and validation of RP-HPLC and RP-UPLC methods for quantification of parathyroid hormones（1-34）in medicinal product formulated with meta-cresol.Journal of Pharmaceutical Analysis，2012，2（2）：136-142
[13] D.K.Gupta，M.K.Verma，R.Anand，et al.Development of a validated UPLC-Qtof-MS/MS method for determination of bioactive constituent from Glycyrrhiza glabra.Journal of Pharmaceutical Analysis，2013，3（3）：205-210
[14] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版第一增补本.北京：化学工业出版社，2010：200
方法：采用ACQUITY UPLC BEH C-18色谱柱；乙腈（A）-水（B）为流动相二元梯度洗脱，检测波长203nm，柱温30℃，流速0.2ml/min，测定同一厂家10批样品以及市售10厂家样品中4种皂苷的含量。
结果：4种活性成分在所建浓度范围内线性关系良好，r均大于0.999。
结论：所建立的UPLC方法可快速、简单地对复方丹参片中4种活性成分进行含量测定。
关键词：UPLC 复方丹参片 三七
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）04-0006-02
复方丹参片由丹参、三七、冰片三味药组成，具有活血化瘀、理气止痛之功效，临床上常用于治疗冠心病、高血压、心绞痛等病。三七为方中主要药物，其味苦、甘，性温，具有活血祛癖，通络止痛的作用。现代药理研究表明三七中所含活性成分主要是皂苷类，其中以人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的含量最高。国内外参考文献中有大量关于复方丹参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定的报导很多，但用UPLC法同时测定几种成分含量的研究少有报导[1-13]。本文利用UPLC法建立了一种同时测定复方丹参片中4种成分含量的方法，并经过验证，认为该方法有效、可行，可作为其质量控制的方法进行推广应用。
1 材料与试剂
1.1 实验材料。样品分别采集于广东省及广西省，具体来源及批号见表1。
1.2 仪器与试药。Waters超高效液相色谱仪，带有二元高压梯度泵、样品处理器、柱温箱、PDA检测器（厂家）；色谱柱ACQUITY UPLC BEH C-18柱（1.7μm，2.1×50mm）；超声清洗器（频率40KHz，功率 300W）（厂家）；CP 224s 型电子分析天平（德国赛多利斯sartorius Sartorius）；Milli-Q纯水处理系统（美国MILLIPO公司）；甲醇（分析纯，乙腈（色谱纯）。三七皂苷R1对照品（110745-200414）、人参皂苷Rg1对照品（110703-201027）、人参皂苷Re对照品（110754-200822）、人参皂苷Rb1对照品（110704-201122）均购自中国食品药品检验所。
2 方法与结果
2.1 样品溶液和对照品溶液的制备。
2.1.1 供试品溶液的制备：取样品10片，除去包衣，精密称重，计算平均片重，研成细粉混匀，精密称取0.5g，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液20ml，称定重量，超声（频率40kHz，功率300W）处理60min，放冷，70%甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，0.45μm滤膜过滤，为供试品溶液[14]。
2.1.2 对照品溶液的制备：配制方法酮“2.4.1”项中，各对照品溶液的第3浓度级别溶液，混合对照品溶液各成分浓度为：三七皂苷R1 83.6μg/ml、人参皂苷Rg1 249.36μg/ml、人参皂苷Re 246μg/ml、人参皂苷Rb1 43.68μg/ml。
2.1.3 空白对照溶液的制备：按处方比例不加三七，制得阴性对照品，按供试品液的制备方法制得阴性对照品溶液。
2.2 色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C-18（1.7μm 2.1*50mm）；柱温为30℃；流速0.200ml/min，进样量2μl，检测波长为203nm流动相采用乙腈（A）-水（B）（V/V）二元梯度系统进行梯度洗脱，线性洗脱梯度为：0～8min时19%A，8～
12min时19%～29%A，12～15min时29%A，15～18min时29%～40%A。
2.3 含量测定方法，精密吸取上述溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。
结果阴性对照品溶液的色谱图中在三七皂苷保留时间处无吸收峰，阴性无干扰。
2.4 标准曲线的绘制。
2.4.1 标准贮备液配制。精密称定各对照品适量，置量瓶中，分别用70%甲醇配制成三七皂苷R1（418μg/ml）、人参皂苷Rg1（415.6μg/ml）、Re（436.8μg/ml）、Rb1（410μg/ml）对照品溶液母液，分别精密量取各对照品母液适量，稀释成5个不同浓度级别的对照品溶液，各级别对照品溶液浓度见表2。
2.4.2 线性关系考查。取上述对照品溶液，进样测定，以峰面积A为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1在各自的线性范围内呈良好的线性关系。各对照品的回归方程、相关系数线性范围以及检测线结果见表3。
2.4.3 方法学考查。
2.4.3.1 精密度试验。取同一个供试品溶液（2121123批次，厂家10），按2.3项下重复进样6次，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，RSD结果见表4。
2.4.3.2 重复性试验 取同一批（2121123批次，厂家10）样品6份，按“2.1.1”项下样品溶液制备方法进行操作，在色谱条件下进样，测得各皂苷的含量，测得平均含量为三七皂苷R1含量0.8688mg/片、人参皂苷Rg1含量3.2526mg/片、人参皂苷Re含量0.3313mg/片、人参皂苷Rb1含量2.5243mg/片。RSD结果见表4。
2.4.3.3 稳定性试验 精密吸取同一批（2121123批次，厂家10）样品溶液，分别在0、1、2、4、6、12、24、36h时在色谱条件下测定，结果表明，供试品溶液在36h内基本稳定。RSD结果见表4。
2.4.3.4 加样回收试验。分别精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品8.36mg、27.56mg、2.81mg、21.23mg，置200ml量瓶中，加70%甲醇至刻度线，配成加样回收用混合对照品溶液。 取已知含量（2121123批次，厂家10；三七皂苷R1含量0.8679mg/片、人参皂苷Rg1含量3.2553mg/片、人参皂苷Re含量0.3341mg/片、人参皂苷Rb1含量2.5228mg/片）的样品0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入加样回收用混合对照品溶液20ml（相当于三七皂苷R1 0.8360mg、人参皂苷Rg1 2.7560mg、人参皂苷Re 0.2810mg、人参皂苷Rb1 2.1230mg），按含量测定方法操作，计算回收率。各皂苷的回收率、RSD结果见表5。
2.5 样品测定。分别取对照品溶液和供试品溶液，进样测定，以外标法用峰面积进行计算4种皂苷的含量。广州某厂家10批样品皂苷类含量结果见表6，市售来自于10个厂家的复方丹参片样品中皂苷类含量结果见表7。
3 讨论
3.1 2010版《中国药典》第一增补本中增加了复方丹参片三七含量的HPLC控制标准，规定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的总量计，不得少于6.0mg/片{规格（1）和规格（3）}。由图1可知，4种成分得到了较好分离，可以对4个成分进行含量测定。参考2010版《中国药典》第一增补本中三七含量控制标准，由表6知某厂家10批复方丹参片中4种皂苷总含量均高于6.0mg/片；市售10个厂家生产的复方丹参片，有两家的未检测到4种皂苷成分，只有一家生产的复方丹参片中4种皂苷总含量高于6.0mg/片，其余几家均低于6.0mg/片。因2010版《中国药典》第一增补本中三七含量控制方法为HPLC法，而本实验中使用的是UPLC法，不同于药典控制方法，所以不能因市售9厂家的测定结果低于6.0mg/片，就判定为不合格。分析市售9厂家4种皂苷总含量低的原因可能是：①样品量少，取样不够全面；②购买样品多为2011年生产，药品放置时间久，导致成分含量降低；③不排除有些厂家未使用合格的三七药材；④生产过程中的工艺参数设置差异，导致检测结果的不同；⑤所购买药品均是在2010版《中国药典》第一增补本施行之前生产并上市出售，厂家可能未严格控制三七药材的质量。
3.2 本研究中，UPLC法仅需18min即将待测成分完全分离，相比于HPLC法需75min内才能将待测成分完全分离，大大缩短了分析时间，提高了分离效率，实现了对复杂物质进行快速分离；并且该方法的精密度、重现性、稳定性、加样回收结果良好。UPLC法使用较少量的流动相，即可达到高效、快速分离的优点，使该方法即可以作为复方丹参片中皂苷成分含量测定方法，又可以在制剂工艺过程中实现对制剂中间提取物进行快速有效分析，从而控制药品质量。
参考文献
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[4] 王菲，李彤，马辰.超高效液相色谱-串联质谱测定中药材中三唑类杀菌剂及三嗪类除草剂的残留量.色谱，2013，31（3）：191-199
[5] 郑文红，蓝义琨.UPLC测定化瘀止痛片人参皂苷Rg1和三七皂苷R1含量实验报告.中国中医药，2012，10（3）：139-140
[6] 张勇，张玲，谢晓梅.一测多评法同时测定木瓜中2种常见三萜酸.中成药，2013，35（4）：770-773
[7] Rhourri-Frih B，Chaimbault P，Dequeral D，et al.Investigation of porous graphic carbon for triterpenoids and natural resinous materials analysis by high performance liquid chromatography hyphenated to mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2012，1240：140-146
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[14] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版第一增补本.北京：化学工业出版社，2010：200