【摘 要】
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目的 构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步研究.方法 利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人LDHA基因,并将其克隆到pE
【机 构】
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军事科学院军事医学研究院生物工程研究所细胞工程研究室,北京,100850;首都医科大学宣武医院呼吸科,北京,100053
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目的 构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步研究.方法 利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人LDHA基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体上,经双酶切和测序鉴定成功后转染到肝癌HepG2细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,免疫荧光检测其亚细胞定位,并利用生长曲线、克隆形成以及划痕实验探究LDHA对肝癌HepG2细胞增殖、迁移能力的影响.结果 从人乳腺文库中扩增获得大小约为1000 bp的DNA片段,并成功克隆至pEGFP-C1载体上,经测序与目的序列完全一致;转染肝癌HepG2细胞后目的基因成功表达;荧光显微镜观察发现,GFP-LDHA融合蛋白主要聚集于细胞质中;细胞生长曲线和克隆形成实验结果显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞增殖能力增强;划痕实验显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞迁移性增强.结论 成功构建了带GFP标签的人LDHA真核表达载体,为进一步研究LDHA在肝癌细胞中的功能奠定了基础.
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