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中图分类号：S828 文献标识码：C 文章编号：1001-0769（2016）07-0075-03
3 结果
3.1 日粮粗蛋白水平对粪便中恶臭化合物浓度的影响
在粗蛋白水平为20 %、17、5 %和15 %的处理组中，酚含量分别为24.03 mg/L、28.84 mg/L和15.58 mg/L（P<0.05），吲哚含量为3.67 mg/L、3.04 mg/L和2.12 mg/L（P<0.05）。15 %粗蛋白组具有最低的酚和吲哚浓度，与粗蛋白20 %的试验组相比，酚浓度降低35 %，吲哚浓度降低42 %。乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸等挥发性脂肪酸的浓度随日粮粗蛋白含量增大而提高，15 %粗蛋白组的SCFA和BCFA含量最低（表2）。
3.2 日粮粗蛋白水平对粪便中菌落组成变化的影响
焦磷酸测序数据：20 %粗蛋白组和15 %粗蛋白组的所有测序reads分别有9 858和13 167个序列。在去除低质量reads后，有7 824（20 %粗蛋白组）和11 156（15 %粗蛋白组）个细菌reads用于后续分析（表3）。在剪去PCR引物后，20 %粗蛋白组和15 %粗蛋白组的平均reads长度分别为505和500。
虽然15 %粗蛋白组中细菌reads数高于 20 %粗蛋白组，但OTUs数量、多样性（香农指数）和丰度（Chao1）却低于20 %粗蛋白组。这一结果表明，15 %粗蛋白组的菌落比20 %粗蛋白组简单。
细菌分类学组成：在门这个分类层面，主要是厚壁菌门，相对丰度比例超过70 %，其次是拟杆菌和变形菌门。厚壁菌门的相对丰度不受日粮处理影响。15 %粗蛋白组的拟杆菌相对丰度（3.3 %）低于20 %粗蛋白组（12.1 %，P<0.05），而20 %粗蛋白组的变形菌丰度（6.8 %）低于15 %粗蛋白组（12.1 %，P<0.05）。在属这个分类层面可看出更细微的差异。其中15 %粗蛋白组中（厚壁菌门）芽孢杆菌纲的链球菌属、芽孢杆菌属和肉杆菌属，（厚壁菌门）梭菌纲的嗜胨菌属和瘤胃菌属，（拟杆菌门）拟杆菌纲的拟杆菌属，（变形菌门）变形菌纲的假单胞菌均低于20 %粗蛋白组，而（厚壁菌门）芽孢杆菌纲的肠球菌属、（厚壁菌门）梭菌纲的梭状芽孢杆菌属和（变形菌门）变形菌纲的丛毛单胞菌属高于20 %粗蛋白组。
3.4 细菌属的相对丰度与粪便恶臭化合物的相关性
酚、吲哚、异丁酸和异戊酸与肉杆菌属、对甲酚和粪臭素与拟杆菌属、乙酸和丁酸与紫单胞菌科AM982595属以及丙酸与组织菌属之间存在显著的相关性。
4 讨论
由于微生物厌氧分解营养素生成恶臭化合物，因此减少营养素的排出对减少恶臭至关重要。尤其是氮的排出是生成恶臭化合物的主要原因。
日粮粗蛋白水平从18 %降低至12 %，生长猪和肥育猪粪便中酚、吲哚、SCFA和BCFA等恶臭化合物生成减少40 %。我们的研究发现，与 20 %粗蛋白试验组相比，15 %粗蛋白组中酚、吲哚、SCFA和BCFA的含量降低35～40 %。酚、吲哚和BCFA比其他化合物具有更高的臭气强度及更低的气味检测阈值。从猪舍、粪便存放地以及施肥土壤中散发出来的吲哚、对甲酚和粪臭素占所有挥发性有机化合物（VOCs）气味活性值的90 %以上，尤其是对甲酚，是VOC排放恶臭的最重要因素。
未消化的日粮蛋白和内源性蛋白通过胃肠道，加速可发酵蛋白质的细菌增殖，生成潜在的恶臭化合物如酚、吲哚和BCFA。在大肠吸收的酚和吲哚随后与肝脏中的葡糖醛酸结合，并通过尿液以葡糖苷酸形式排出。在粪便中，尿葡糖苷酸通过粪便β-葡萄糖醛酸酶催化水解，释放出酚和吲哚。有报道指出，日粮蛋白质摄入量和尿液酚排出之间存在正相关。降低日粮粗蛋白水平，使得氮排放减少，从而降低猪粪便中细菌的发酵。因此，日粮粗蛋白水平从20 %降低到15 %，可能减少蛋白质发酵期间代谢的酚、吲哚和BCFA。
与细菌培养技术计数相比，焦磷酸测序技术无需培养，可提供更为准确的菌落信息。基于 16s rRNA基因序列的多重bar-coded焦磷酸测序技术能够识别低至1 %的菌落。因此，这种技术已被用于分析大肠和粪便中的多种细菌，并用于解释与恶臭化合物生成有关的新菌落。
来源于蛋白质的氮和氨基酸为分解糖和不分解糖的细菌生长提供能量来源。提供过量日粮蛋白可导致多种肠道细菌大量增殖，因为过量或未消化的蛋白质被用作细菌发酵的底物。我们发现，15 %粗蛋白组中菌群多样性低于20 %粗蛋白组，这表明这些菌群对猪日粮蛋白水平的细微变化非常敏感。
与以前的研究相似，本研究中细菌分类情况表明，厚壁菌、拟杆菌以及变形菌是主要的细菌类别。构成大多数肠道细菌的厚壁菌和拟杆菌数与碳水化合物和蛋白质代谢有关。这两个门的细菌被用作进化标记物，因为其丰度容易受胃肠道中发酵条件的影响。在我们的研究中，与15 %粗蛋白组相比，20 %粗蛋白组的拟杆菌相对丰度较高，但变形菌丰度较低。
细菌丰度的改变与猪粪中生成的恶臭化合物组成有关。拟杆菌在进行脱氨基和脱羧基过程中，可生成最为恶臭的化合物之一粪臭素。与此相反，粪臭素含量较高的样品中，变形菌相对丰度较低。大多数细菌在代谢氨基酸时会生成VFA、酚和吲哚。拟杆菌、丙酸杆菌、梭状芽孢杆菌、真杆菌和链球菌将甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸代谢为乙酸。氨基酸的微生物代谢也会生成其他挥发性脂肪酸，比如谷氨酸和赖氨酸会生成丁酸，丙氨酸和苏氨酸生成丙酸，缬氨酸生成异丁酸，亮氨酸和异亮氨酸生成异戊酸。此外，拟杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、梭菌以及消化链球菌通过代谢芳香化合物如酪氨酸和色氨酸生成酚和吲哚。念球菌、芽孢杆菌、肉杆菌、拟杆菌及假单胞菌将色氨酸代谢为吲哚-3-乳酸，并在粪便中分解为吲哚和粪臭素。我们的研究发现，15 %粗蛋白组中，生成吲哚和粪臭素的成分含量低于20 %粗蛋白组。此外，芽孢杆菌、拟杆菌和假单胞菌通过支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的脱氨基作用生成BCFA。拟杆菌类分泌各种大量的蛋白酶，分解内源性和外源性蛋白。细菌蛋白酶的行为类似于弹性蛋白酶，会破坏刷状缘的麦芽糖酶和蔗糖酶。嗜胨菌作为不分解糖的细菌可利用蛋白质作为能量来源，并生成BCFA和吲哚。与拟杆菌相比，在15 %粗蛋白组中含量更高的梭菌生成的SCFA、BCFA和吲哚的量少于高蛋白组（20 %）。这些结果表明，改变日粮蛋白水平可调节菌落组成和相对菌群丰度。
酚、吲哚、异丁酸和异戊酸与肉杆菌存在强烈的正相关。肉杆菌可将缬氨酸和色氨酸代谢为BCFA和吲哚，并与鸡粪中VOC中酚类存在强烈的正相关。拟杆菌是革兰氏阴性和专性厌氧菌属，提供了对疏水性分子有效的屏障，因此可将疏水性氨基酸，包括色氨酸和酪氨酸以及芳香氨基酸代谢为酚、吲哚及其前体。对甲酚和粪臭素的生成也与拟杆菌呈现正相关。我们发现乙酸和丁酸与紫单胞菌科、丙酸与组织菌之间也存在强烈的正相关。紫单胞菌科细菌生成多种挥发性有机物，如该科的蛋白水解菌从多种氨基酸产生乙酸、丙酸和丁酸。组织菌是一种革兰氏阳性菌，最初从人粪便中分离，可产生乙酸，是分解肌酸酐的中间物质。这些结果表明，肉杆菌及拟杆菌与酚、吲哚和BCFA等恶臭化合物之间存在强烈的正相关。
5 结论
本研究结果表明，调整日粮粗蛋白水平会影响恶臭化合物及微生物菌群的组成。添加15 %的粗蛋白而不是20 %的粗蛋白可显著降低猪粪中恶臭化合物。焦磷酸测序分类分析表明，恶臭化合物和菌群之间存在强相关。更进一步的研究将侧重查明细菌代谢的确切机制，并在猪舍中应用恶臭生成的预测模型。
3 结果
3.1 日粮粗蛋白水平对粪便中恶臭化合物浓度的影响
在粗蛋白水平为20 %、17、5 %和15 %的处理组中，酚含量分别为24.03 mg/L、28.84 mg/L和15.58 mg/L（P<0.05），吲哚含量为3.67 mg/L、3.04 mg/L和2.12 mg/L（P<0.05）。15 %粗蛋白组具有最低的酚和吲哚浓度，与粗蛋白20 %的试验组相比，酚浓度降低35 %，吲哚浓度降低42 %。乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸等挥发性脂肪酸的浓度随日粮粗蛋白含量增大而提高，15 %粗蛋白组的SCFA和BCFA含量最低（表2）。
3.2 日粮粗蛋白水平对粪便中菌落组成变化的影响
焦磷酸测序数据：20 %粗蛋白组和15 %粗蛋白组的所有测序reads分别有9 858和13 167个序列。在去除低质量reads后，有7 824（20 %粗蛋白组）和11 156（15 %粗蛋白组）个细菌reads用于后续分析（表3）。在剪去PCR引物后，20 %粗蛋白组和15 %粗蛋白组的平均reads长度分别为505和500。
虽然15 %粗蛋白组中细菌reads数高于 20 %粗蛋白组，但OTUs数量、多样性（香农指数）和丰度（Chao1）却低于20 %粗蛋白组。这一结果表明，15 %粗蛋白组的菌落比20 %粗蛋白组简单。
细菌分类学组成：在门这个分类层面，主要是厚壁菌门，相对丰度比例超过70 %，其次是拟杆菌和变形菌门。厚壁菌门的相对丰度不受日粮处理影响。15 %粗蛋白组的拟杆菌相对丰度（3.3 %）低于20 %粗蛋白组（12.1 %，P<0.05），而20 %粗蛋白组的变形菌丰度（6.8 %）低于15 %粗蛋白组（12.1 %，P<0.05）。在属这个分类层面可看出更细微的差异。其中15 %粗蛋白组中（厚壁菌门）芽孢杆菌纲的链球菌属、芽孢杆菌属和肉杆菌属，（厚壁菌门）梭菌纲的嗜胨菌属和瘤胃菌属，（拟杆菌门）拟杆菌纲的拟杆菌属，（变形菌门）变形菌纲的假单胞菌均低于20 %粗蛋白组，而（厚壁菌门）芽孢杆菌纲的肠球菌属、（厚壁菌门）梭菌纲的梭状芽孢杆菌属和（变形菌门）变形菌纲的丛毛单胞菌属高于20 %粗蛋白组。
3.4 细菌属的相对丰度与粪便恶臭化合物的相关性
酚、吲哚、异丁酸和异戊酸与肉杆菌属、对甲酚和粪臭素与拟杆菌属、乙酸和丁酸与紫单胞菌科AM982595属以及丙酸与组织菌属之间存在显著的相关性。
4 讨论
由于微生物厌氧分解营养素生成恶臭化合物，因此减少营养素的排出对减少恶臭至关重要。尤其是氮的排出是生成恶臭化合物的主要原因。
日粮粗蛋白水平从18 %降低至12 %，生长猪和肥育猪粪便中酚、吲哚、SCFA和BCFA等恶臭化合物生成减少40 %。我们的研究发现，与 20 %粗蛋白试验组相比，15 %粗蛋白组中酚、吲哚、SCFA和BCFA的含量降低35～40 %。酚、吲哚和BCFA比其他化合物具有更高的臭气强度及更低的气味检测阈值。从猪舍、粪便存放地以及施肥土壤中散发出来的吲哚、对甲酚和粪臭素占所有挥发性有机化合物（VOCs）气味活性值的90 %以上，尤其是对甲酚，是VOC排放恶臭的最重要因素。
未消化的日粮蛋白和内源性蛋白通过胃肠道，加速可发酵蛋白质的细菌增殖，生成潜在的恶臭化合物如酚、吲哚和BCFA。在大肠吸收的酚和吲哚随后与肝脏中的葡糖醛酸结合，并通过尿液以葡糖苷酸形式排出。在粪便中，尿葡糖苷酸通过粪便β-葡萄糖醛酸酶催化水解，释放出酚和吲哚。有报道指出，日粮蛋白质摄入量和尿液酚排出之间存在正相关。降低日粮粗蛋白水平，使得氮排放减少，从而降低猪粪便中细菌的发酵。因此，日粮粗蛋白水平从20 %降低到15 %，可能减少蛋白质发酵期间代谢的酚、吲哚和BCFA。
与细菌培养技术计数相比，焦磷酸测序技术无需培养，可提供更为准确的菌落信息。基于 16s rRNA基因序列的多重bar-coded焦磷酸测序技术能够识别低至1 %的菌落。因此，这种技术已被用于分析大肠和粪便中的多种细菌，并用于解释与恶臭化合物生成有关的新菌落。
来源于蛋白质的氮和氨基酸为分解糖和不分解糖的细菌生长提供能量来源。提供过量日粮蛋白可导致多种肠道细菌大量增殖，因为过量或未消化的蛋白质被用作细菌发酵的底物。我们发现，15 %粗蛋白组中菌群多样性低于20 %粗蛋白组，这表明这些菌群对猪日粮蛋白水平的细微变化非常敏感。
与以前的研究相似，本研究中细菌分类情况表明，厚壁菌、拟杆菌以及变形菌是主要的细菌类别。构成大多数肠道细菌的厚壁菌和拟杆菌数与碳水化合物和蛋白质代谢有关。这两个门的细菌被用作进化标记物，因为其丰度容易受胃肠道中发酵条件的影响。在我们的研究中，与15 %粗蛋白组相比，20 %粗蛋白组的拟杆菌相对丰度较高，但变形菌丰度较低。
细菌丰度的改变与猪粪中生成的恶臭化合物组成有关。拟杆菌在进行脱氨基和脱羧基过程中，可生成最为恶臭的化合物之一粪臭素。与此相反，粪臭素含量较高的样品中，变形菌相对丰度较低。大多数细菌在代谢氨基酸时会生成VFA、酚和吲哚。拟杆菌、丙酸杆菌、梭状芽孢杆菌、真杆菌和链球菌将甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸代谢为乙酸。氨基酸的微生物代谢也会生成其他挥发性脂肪酸，比如谷氨酸和赖氨酸会生成丁酸，丙氨酸和苏氨酸生成丙酸，缬氨酸生成异丁酸，亮氨酸和异亮氨酸生成异戊酸。此外，拟杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、梭菌以及消化链球菌通过代谢芳香化合物如酪氨酸和色氨酸生成酚和吲哚。念球菌、芽孢杆菌、肉杆菌、拟杆菌及假单胞菌将色氨酸代谢为吲哚-3-乳酸，并在粪便中分解为吲哚和粪臭素。我们的研究发现，15 %粗蛋白组中，生成吲哚和粪臭素的成分含量低于20 %粗蛋白组。此外，芽孢杆菌、拟杆菌和假单胞菌通过支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的脱氨基作用生成BCFA。拟杆菌类分泌各种大量的蛋白酶，分解内源性和外源性蛋白。细菌蛋白酶的行为类似于弹性蛋白酶，会破坏刷状缘的麦芽糖酶和蔗糖酶。嗜胨菌作为不分解糖的细菌可利用蛋白质作为能量来源，并生成BCFA和吲哚。与拟杆菌相比，在15 %粗蛋白组中含量更高的梭菌生成的SCFA、BCFA和吲哚的量少于高蛋白组（20 %）。这些结果表明，改变日粮蛋白水平可调节菌落组成和相对菌群丰度。
酚、吲哚、异丁酸和异戊酸与肉杆菌存在强烈的正相关。肉杆菌可将缬氨酸和色氨酸代谢为BCFA和吲哚，并与鸡粪中VOC中酚类存在强烈的正相关。拟杆菌是革兰氏阴性和专性厌氧菌属，提供了对疏水性分子有效的屏障，因此可将疏水性氨基酸，包括色氨酸和酪氨酸以及芳香氨基酸代谢为酚、吲哚及其前体。对甲酚和粪臭素的生成也与拟杆菌呈现正相关。我们发现乙酸和丁酸与紫单胞菌科、丙酸与组织菌之间也存在强烈的正相关。紫单胞菌科细菌生成多种挥发性有机物，如该科的蛋白水解菌从多种氨基酸产生乙酸、丙酸和丁酸。组织菌是一种革兰氏阳性菌，最初从人粪便中分离，可产生乙酸，是分解肌酸酐的中间物质。这些结果表明，肉杆菌及拟杆菌与酚、吲哚和BCFA等恶臭化合物之间存在强烈的正相关。
5 结论
本研究结果表明，调整日粮粗蛋白水平会影响恶臭化合物及微生物菌群的组成。添加15 %的粗蛋白而不是20 %的粗蛋白可显著降低猪粪中恶臭化合物。焦磷酸测序分类分析表明，恶臭化合物和菌群之间存在强相关。更进一步的研究将侧重查明细菌代谢的确切机制，并在猪舍中应用恶臭生成的预测模型。