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摘要： 对粳稻“嘉花1号”经60Coγ诱变处理获得的稳定遗传低温敏感叶色突变体tcm11（thermosensitive chloroplast mutant 11）进行了表型鉴定与遗传分析.在20 ℃条件下，该突变体三叶期之前幼苗均表现为黄色，光合色素含量明显下降，叶绿体发育不完整，从第4叶开始逐渐转为浅黄绿色直至最后死亡.而在32 ℃条件下，其表型与野生型相比没有明显差异，具有低温敏感属性.通过对培矮64S与tcm11杂交的F2代分离群体进行遗传分析，发现该低温敏感突变体性状是受单个隐性核基因（tcm11）控制，利用图位克隆技术对tcm11进行定位，将其定位在第11号染色体的InDel分子标记ID13252与SSR分子标记MM1361之间一个约1 566 kb的区域内.这也为后续的研究奠定了基础.
关键词： 水稻； 温度敏感叶色突变体； 基因定位
中图分类号： Q 344 文献标志码： A 文章编号： 10005137（2017）02031907
Abstract： A stable geneticlow temperature sensitive leaf color mutant tcm11 （thermosensitive chloroplast mutant11） derived from Japonicarice variety Jiahua No.1 treated by 60Co γrays was used in this study，whichwasidentified the phenotypic characterization and genetic analysis.Underthe condition of 20 ℃，the tcm11 mutant was showed the etiolation phenotype before 3leafstage，which were greatly reduced the photosynthetic pigment contents andbroken the chloroplast structure.However，it began to turn the yellow green phenotype after 4leafstageuntil it died.But under the condition of 32 ℃，its phenotype was no significant difference compared with wild type（Jiahua No.1），with low temperature sensitive attributes.Using segregatingindividuals from cross of Pei′ai 64S and tcm11，genetic analysis revealed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.Through mapbased cloning，the mutant gene （tcm11） was located to 1 566 kb region between the molecular markers ID13252 and MM1361 on rice chromosome 11，which also the followup research laid the foundation for in the future.
Key words： rice （Oryza sativa）； temperature sensitive leaf color mutant； gene mapping
0 引 言
水稻是世界上第二大糧食作物，也是中国最主要的粮食作物之一[1]，因此如何提高水稻的产量以解决日益严峻的粮食不足问题显得越发重要.光合作用是影响水稻产量的关键因素之一，而叶片是进行光合作用的主要器官，叶色在很大程度上决定了光合作用的效率[2].叶绿体是植物进行光合作用的场所，它是半自主性细胞器，由前质体发育而来，其正常发育需要核基因和叶绿体基因相互协调[3].自然或非自然因素都会导致与叶绿素合成或叶绿体发育相关的基因发生突变，造成叶绿素合成或降解受阻，叶绿体发育缺陷，最终引起叶色的变化.水稻叶色突变体种类很多，有一类突变体在不同温度条件下会呈现不同的叶色表型，根据温度对叶色标记表达的影响，将水稻叶色突变体分为3种，即高温表达型、低温表达型和温钝型[4].低温表达型（水稻低温敏感叶色）突变体是指水稻突变体的叶色表型在一个相对低的温度条件下才会发生与正常叶色有差异的变化.目前报道有cde2[5]、mr21[6]、Fan5[7]、tsc1[8]、tsl11[9]、tcm12[10]、tws[11]、lta1[12]、1103（s）[13]、v4[14]和v9[14]等，但其低温诱导临界温度从20～28 ℃不等[15].另外，根据在低温条件下的生长情况，又可分为低温敏感致死型（如osv4）和低温敏感转绿型（如cde2）[15].
本文作者通过60Coγ辐射水稻粳稻“嘉花1号”得到一个新的低温敏感叶色突变体tcm11，对该突变体的叶色表型、光合色素、叶绿体显微结构进行观察和分析，并利用了SSR及InDel分子标记对该突变基因进行了定位，为该基因的分子克隆及其作用机理的研究奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材 料
实验所用的低温敏感叶色突变体tcm11是从粳稻“嘉花1号”种子经60Coγ射线辐照后诱变所获得的，经多代自交繁育和选种，其农艺性状已经稳定.
1.2 方 法 1.2.1 tcm11苗期葉色表型观察
将突变体tcm11与野生型“嘉花1号”（WT）的种子分别在32 ℃条件下催芽3 d，然后将萌发的种子播种后分别置于20和32 ℃的光照培养箱（GXZ智能型，宁波江南仪器厂）中培养，每天光照12 h，光子照度为180 μmol/（m2·s）.每隔3 d观察一次幼苗的生长情况，并适时观察记录叶片表型的变化.
1.2.2 叶片光合色素含量的测定
叶片光合色素含量的测定及计算方法参考[16].本实验所取叶片是生长在20和32 ℃条件下的突变体tcm11和野生型“嘉花1号”的三叶期时的叶片，剪其第三叶片中间区域，称取0.02 g，剪碎后放入具塞试管，加入5 mL叶绿素提取液（V（乙醇）∶V（丙酮）∶V（水）=5∶4∶1）到试管中，轻轻摇匀，后置于室温黑暗的环境中处理18 h，直至叶片完全褪色.然后，利用METASHUV5100分光光度计分别测定提取液在470、645和663 nm下的吸光度值，并利用该值分别计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量.实验重复3次，取平均值.
1.2.3 叶绿体显微结构观察
叶片取样与1.2.2相同，然后延叶脉方向剪成1 mm2的小正方形，之后立即放入质量分数为2.5%的戊二醛固定液（V（25%戊二醛）∶V（0.2 mol/L磷酸缓冲液）∶V（无菌水）=1∶4∶5）中，24 h后换新鲜固定液，4 ℃保存，固定好之后，进行清洗，再固定，洗涤，脱水与硬化，置换，浸渍，包埋，聚合，修块，切片，染色等一系列过程处理后，用透射电镜（Hitachi765型）进行观察拍照.
1.2.4 遗传分析和定位群体的构建
2013年在上海以tcm11突变体为父本与母本培矮64S进行杂交配组，获得F1种子，2014年冬季F1种子种植在海南三亚，自交繁殖获得F2种子，作为遗传分析和定位群体.
1.2.5 水稻DNA的提取
本研究中，利用CTAB法[17]分别提取tcm11与培矮64S亲本植株的DNA，而其F2代定位群体的DNA则是用快速简便TPS法[18]进行提取.
1.2.6 基因定位
首先利用本实验室保存的SSR及InDel的分子标记检测突变体tcm11和培矮64S的多态性，然后选取均匀分布在水稻12条染色体上的有多态性的引物，随机挑选F2中低温（20 ℃）分离出的22株黄绿苗作连锁分析，定位突变基因所在染色体，并进一步扩大F2群体进行遗传定位.在目标区域内通过NCBI公布的粳稻日本晴和籼稻9311的全基因组序列的差异InDel位点，利用Primer Premier5.0软件设计引物（引物由上海生工生物工程技术服务公司合成）（表1），对突变基因进行进一步定位.应用MAPMAKER/EXP3.0软件[19]，构建目的基因区域的遗传图谱.PCR反应体系包括：2μL模板DNA、1 μL 10 μmol/L引物、2.5 μL buffer for Taq DNA Pol、0.5 μL dNTP、1 μL DMSO、12 μL ddH2O、1 μL Taq酶（5U/μL），在Eppendorf和东胜PCR仪上进行扩增.PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（退火温度随不同引物而变化），72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min.反应产物用2.5%～3.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，并拍照记录.
2 结果与分析
2.1 突变体的表型
通过对突变体tcm11和野生型“嘉花1号”植株苗期叶色表型的观察（图1），结果显示当生长于20 ℃条件下时，tcm11从发芽后长出的叶鞘，第1叶（不完全叶）、第2叶及第3叶期幼苗均表现为黄化表型，从第4叶期开始，叶片逐渐转为浅黄绿色，如图1（a）所示，且在随后的生长过程中持续保持直至最后死亡.当其生长于32 ℃条件下时，tcm11的植株表型与野生型没有明显差异，如图1（b）所示.这表明tcm11的表型与生长温度和幼苗叶龄密切相关，即突变体的叶色具有低温敏感属性.
2.2 突变体的光合色素含量变化
对在不同温度条件下突变体tcm11和野生型“嘉花1号”幼苗的三叶期叶片的光合色素测定结果（图2）显示，在20 ℃条件下，tcm11的光合色素含量（包括叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素）与野生型相比明显降低，如图2（a）所示；而在32 ℃条件下，tcm11和野生型的光合色素含量无明显差异，如图2（b）所示.此结果表明，tcm11在20 ℃下叶片中叶绿素含量明显下降，导致植株表现为黄化.
2.3 突变体叶绿体显微结构
对突变体tcm11和野生型“嘉花1号”在20和32 ℃下生长至三叶期的第3叶的叶绿体显微结构观察（图3），发现野生型“嘉花1号”无论在高温和低温条件下，叶绿体内部都存在完整清晰的内囊体片层结构，如图3（a），（c）所示；突变体tcm11在20 ℃下，几乎观察不到一个完整的叶绿体，并且含有较多空泡，如图3（d）所示，而在32 ℃下，与野生型无明显差异，如图3（b）所示.这说明突变体tcm11在低温条件下叶绿体分化发育受到影响，导致光合色素不能正常积累，从而产生突变表型.
2.4 遗传分析
在20 ℃条件下生长的培矮64S/tcm11杂交所获得的F1代植株表型呈现正常的绿色，而F2代群体中分离出黄化苗和正常苗.对431株F2代分离群体中的黄绿苗与正常表型数进行统计，发现其中334株呈现正常表型，97株呈现突变表型，其F2代的叶色分离比符合3∶1（χ2=1.43<χ20.05=3.84），说明此突变性状是受单个隐性核基因（tcm11）控制. 2.5 基因定位
3 結 论
水稻不仅是重要的粮食作物，也是单子叶植物和禾本科的模式植物，所以对水稻的功能基因研究极为广泛，近来人们对水稻叶色突变体尤其是温敏感叶色突变体的研究更为关注[15].鉴于温度对水稻温敏感叶色突变体叶绿体发育的影响，可以利用它们探究水稻的叶绿素合成、叶绿体发育、光合温度响应分子机制，同时在水稻遗传改良、高产育种具有一定的应用价值.
到目前为止，与tcm11定位于相同染色体且为低温敏感叶色突变体的已知突变基因有tsl11[9]，该突变体为一个幼苗叶色温敏突变，在20 ℃条件下，与本研究中tcm11略有不同，幼苗叶色呈黄色，光合色素含量下降，叶绿体内部结构不完整；而在32 ℃条件下，其表型与野生型基本一致.经遗传分析表明，该tsl11突变体叶色性状受一对隐性核基因控制，该tsl11基因定位在ID14506与ID14653之的147 kb的区间内.还有tcs1[8]，该突变体在23.1 ℃条件下，为白化表型；而在30.1 ℃条件下，为与野生型相同的绿色表型.另外v4[14]和v9[14]，这两种突变体在20 ℃条件下，都为黄白色表型；而在30 ℃条件下，都表现为与野生型相同的绿色表型.虽然以上4种突变体都属于低温敏感叶色突变体，都与tcm11表型有些类似，但从基因定位区间上或表型不同来看，推测tcm11有可能是一个新的低温敏感叶色突变体.
本研究发现，tcm11突变体在低温（20 ℃）条件下，其叶绿体的形成在叶片发育过程中受到严重阻碍，叶绿素无法正常合成，导致幼苗呈黄化转黄绿表型；而在高温（32 ℃）条件下，其表型及各项指标又恢复到与野生型基本一致的水平.由此推断，TCM11基因参与光合色素合成/叶绿体发育不仅与温度有关，而且与幼苗的叶龄有一定的关系，与已报道突变体cde2[5]和tcd9[15]等相类似.同时，本实验在基因定位过程中，采用3504个单株的F2分离群体，tcm11突变基因仍定位在分子标记ID13252与MM1361之间1 566 kb的一个较大区域，从两分子标记的位置来看，该基因位于着丝粒附近.着丝粒附近的交换率通常较低，增加了目的基因图位克隆的难度[20].今后，将在此基础上扩大定位群体，发展更多新的分子标记，以及找到解决着丝粒附近交换率低的方法，进一步对该基因进行克隆和功能分析，这也将有助于加深温度对水稻叶绿体发育分子作用机理的了解.
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（责任编辑：顾浩然）
关键词： 水稻； 温度敏感叶色突变体； 基因定位
中图分类号： Q 344 文献标志码： A 文章编号： 10005137（2017）02031907
Abstract： A stable geneticlow temperature sensitive leaf color mutant tcm11 （thermosensitive chloroplast mutant11） derived from Japonicarice variety Jiahua No.1 treated by 60Co γrays was used in this study，whichwasidentified the phenotypic characterization and genetic analysis.Underthe condition of 20 ℃，the tcm11 mutant was showed the etiolation phenotype before 3leafstage，which were greatly reduced the photosynthetic pigment contents andbroken the chloroplast structure.However，it began to turn the yellow green phenotype after 4leafstageuntil it died.But under the condition of 32 ℃，its phenotype was no significant difference compared with wild type（Jiahua No.1），with low temperature sensitive attributes.Using segregatingindividuals from cross of Pei′ai 64S and tcm11，genetic analysis revealed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.Through mapbased cloning，the mutant gene （tcm11） was located to 1 566 kb region between the molecular markers ID13252 and MM1361 on rice chromosome 11，which also the followup research laid the foundation for in the future.
Key words： rice （Oryza sativa）； temperature sensitive leaf color mutant； gene mapping
0 引 言
水稻是世界上第二大糧食作物，也是中国最主要的粮食作物之一[1]，因此如何提高水稻的产量以解决日益严峻的粮食不足问题显得越发重要.光合作用是影响水稻产量的关键因素之一，而叶片是进行光合作用的主要器官，叶色在很大程度上决定了光合作用的效率[2].叶绿体是植物进行光合作用的场所，它是半自主性细胞器，由前质体发育而来，其正常发育需要核基因和叶绿体基因相互协调[3].自然或非自然因素都会导致与叶绿素合成或叶绿体发育相关的基因发生突变，造成叶绿素合成或降解受阻，叶绿体发育缺陷，最终引起叶色的变化.水稻叶色突变体种类很多，有一类突变体在不同温度条件下会呈现不同的叶色表型，根据温度对叶色标记表达的影响，将水稻叶色突变体分为3种，即高温表达型、低温表达型和温钝型[4].低温表达型（水稻低温敏感叶色）突变体是指水稻突变体的叶色表型在一个相对低的温度条件下才会发生与正常叶色有差异的变化.目前报道有cde2[5]、mr21[6]、Fan5[7]、tsc1[8]、tsl11[9]、tcm12[10]、tws[11]、lta1[12]、1103（s）[13]、v4[14]和v9[14]等，但其低温诱导临界温度从20～28 ℃不等[15].另外，根据在低温条件下的生长情况，又可分为低温敏感致死型（如osv4）和低温敏感转绿型（如cde2）[15].
本文作者通过60Coγ辐射水稻粳稻“嘉花1号”得到一个新的低温敏感叶色突变体tcm11，对该突变体的叶色表型、光合色素、叶绿体显微结构进行观察和分析，并利用了SSR及InDel分子标记对该突变基因进行了定位，为该基因的分子克隆及其作用机理的研究奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材 料
实验所用的低温敏感叶色突变体tcm11是从粳稻“嘉花1号”种子经60Coγ射线辐照后诱变所获得的，经多代自交繁育和选种，其农艺性状已经稳定.
1.2 方 法 1.2.1 tcm11苗期葉色表型观察
将突变体tcm11与野生型“嘉花1号”（WT）的种子分别在32 ℃条件下催芽3 d，然后将萌发的种子播种后分别置于20和32 ℃的光照培养箱（GXZ智能型，宁波江南仪器厂）中培养，每天光照12 h，光子照度为180 μmol/（m2·s）.每隔3 d观察一次幼苗的生长情况，并适时观察记录叶片表型的变化.
1.2.2 叶片光合色素含量的测定
叶片光合色素含量的测定及计算方法参考[16].本实验所取叶片是生长在20和32 ℃条件下的突变体tcm11和野生型“嘉花1号”的三叶期时的叶片，剪其第三叶片中间区域，称取0.02 g，剪碎后放入具塞试管，加入5 mL叶绿素提取液（V（乙醇）∶V（丙酮）∶V（水）=5∶4∶1）到试管中，轻轻摇匀，后置于室温黑暗的环境中处理18 h，直至叶片完全褪色.然后，利用METASHUV5100分光光度计分别测定提取液在470、645和663 nm下的吸光度值，并利用该值分别计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量.实验重复3次，取平均值.
1.2.3 叶绿体显微结构观察
叶片取样与1.2.2相同，然后延叶脉方向剪成1 mm2的小正方形，之后立即放入质量分数为2.5%的戊二醛固定液（V（25%戊二醛）∶V（0.2 mol/L磷酸缓冲液）∶V（无菌水）=1∶4∶5）中，24 h后换新鲜固定液，4 ℃保存，固定好之后，进行清洗，再固定，洗涤，脱水与硬化，置换，浸渍，包埋，聚合，修块，切片，染色等一系列过程处理后，用透射电镜（Hitachi765型）进行观察拍照.
1.2.4 遗传分析和定位群体的构建
2013年在上海以tcm11突变体为父本与母本培矮64S进行杂交配组，获得F1种子，2014年冬季F1种子种植在海南三亚，自交繁殖获得F2种子，作为遗传分析和定位群体.
1.2.5 水稻DNA的提取
本研究中，利用CTAB法[17]分别提取tcm11与培矮64S亲本植株的DNA，而其F2代定位群体的DNA则是用快速简便TPS法[18]进行提取.
1.2.6 基因定位
首先利用本实验室保存的SSR及InDel的分子标记检测突变体tcm11和培矮64S的多态性，然后选取均匀分布在水稻12条染色体上的有多态性的引物，随机挑选F2中低温（20 ℃）分离出的22株黄绿苗作连锁分析，定位突变基因所在染色体，并进一步扩大F2群体进行遗传定位.在目标区域内通过NCBI公布的粳稻日本晴和籼稻9311的全基因组序列的差异InDel位点，利用Primer Premier5.0软件设计引物（引物由上海生工生物工程技术服务公司合成）（表1），对突变基因进行进一步定位.应用MAPMAKER/EXP3.0软件[19]，构建目的基因区域的遗传图谱.PCR反应体系包括：2μL模板DNA、1 μL 10 μmol/L引物、2.5 μL buffer for Taq DNA Pol、0.5 μL dNTP、1 μL DMSO、12 μL ddH2O、1 μL Taq酶（5U/μL），在Eppendorf和东胜PCR仪上进行扩增.PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（退火温度随不同引物而变化），72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min.反应产物用2.5%～3.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，并拍照记录.
2 结果与分析
2.1 突变体的表型
通过对突变体tcm11和野生型“嘉花1号”植株苗期叶色表型的观察（图1），结果显示当生长于20 ℃条件下时，tcm11从发芽后长出的叶鞘，第1叶（不完全叶）、第2叶及第3叶期幼苗均表现为黄化表型，从第4叶期开始，叶片逐渐转为浅黄绿色，如图1（a）所示，且在随后的生长过程中持续保持直至最后死亡.当其生长于32 ℃条件下时，tcm11的植株表型与野生型没有明显差异，如图1（b）所示.这表明tcm11的表型与生长温度和幼苗叶龄密切相关，即突变体的叶色具有低温敏感属性.
2.2 突变体的光合色素含量变化
对在不同温度条件下突变体tcm11和野生型“嘉花1号”幼苗的三叶期叶片的光合色素测定结果（图2）显示，在20 ℃条件下，tcm11的光合色素含量（包括叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素）与野生型相比明显降低，如图2（a）所示；而在32 ℃条件下，tcm11和野生型的光合色素含量无明显差异，如图2（b）所示.此结果表明，tcm11在20 ℃下叶片中叶绿素含量明显下降，导致植株表现为黄化.
2.3 突变体叶绿体显微结构
对突变体tcm11和野生型“嘉花1号”在20和32 ℃下生长至三叶期的第3叶的叶绿体显微结构观察（图3），发现野生型“嘉花1号”无论在高温和低温条件下，叶绿体内部都存在完整清晰的内囊体片层结构，如图3（a），（c）所示；突变体tcm11在20 ℃下，几乎观察不到一个完整的叶绿体，并且含有较多空泡，如图3（d）所示，而在32 ℃下，与野生型无明显差异，如图3（b）所示.这说明突变体tcm11在低温条件下叶绿体分化发育受到影响，导致光合色素不能正常积累，从而产生突变表型.
2.4 遗传分析
在20 ℃条件下生长的培矮64S/tcm11杂交所获得的F1代植株表型呈现正常的绿色，而F2代群体中分离出黄化苗和正常苗.对431株F2代分离群体中的黄绿苗与正常表型数进行统计，发现其中334株呈现正常表型，97株呈现突变表型，其F2代的叶色分离比符合3∶1（χ2=1.43<χ20.05=3.84），说明此突变性状是受单个隐性核基因（tcm11）控制. 2.5 基因定位
3 結 论
水稻不仅是重要的粮食作物，也是单子叶植物和禾本科的模式植物，所以对水稻的功能基因研究极为广泛，近来人们对水稻叶色突变体尤其是温敏感叶色突变体的研究更为关注[15].鉴于温度对水稻温敏感叶色突变体叶绿体发育的影响，可以利用它们探究水稻的叶绿素合成、叶绿体发育、光合温度响应分子机制，同时在水稻遗传改良、高产育种具有一定的应用价值.
到目前为止，与tcm11定位于相同染色体且为低温敏感叶色突变体的已知突变基因有tsl11[9]，该突变体为一个幼苗叶色温敏突变，在20 ℃条件下，与本研究中tcm11略有不同，幼苗叶色呈黄色，光合色素含量下降，叶绿体内部结构不完整；而在32 ℃条件下，其表型与野生型基本一致.经遗传分析表明，该tsl11突变体叶色性状受一对隐性核基因控制，该tsl11基因定位在ID14506与ID14653之的147 kb的区间内.还有tcs1[8]，该突变体在23.1 ℃条件下，为白化表型；而在30.1 ℃条件下，为与野生型相同的绿色表型.另外v4[14]和v9[14]，这两种突变体在20 ℃条件下，都为黄白色表型；而在30 ℃条件下，都表现为与野生型相同的绿色表型.虽然以上4种突变体都属于低温敏感叶色突变体，都与tcm11表型有些类似，但从基因定位区间上或表型不同来看，推测tcm11有可能是一个新的低温敏感叶色突变体.
本研究发现，tcm11突变体在低温（20 ℃）条件下，其叶绿体的形成在叶片发育过程中受到严重阻碍，叶绿素无法正常合成，导致幼苗呈黄化转黄绿表型；而在高温（32 ℃）条件下，其表型及各项指标又恢复到与野生型基本一致的水平.由此推断，TCM11基因参与光合色素合成/叶绿体发育不仅与温度有关，而且与幼苗的叶龄有一定的关系，与已报道突变体cde2[5]和tcd9[15]等相类似.同时，本实验在基因定位过程中，采用3504个单株的F2分离群体，tcm11突变基因仍定位在分子标记ID13252与MM1361之间1 566 kb的一个较大区域，从两分子标记的位置来看，该基因位于着丝粒附近.着丝粒附近的交换率通常较低，增加了目的基因图位克隆的难度[20].今后，将在此基础上扩大定位群体，发展更多新的分子标记，以及找到解决着丝粒附近交换率低的方法，进一步对该基因进行克隆和功能分析，这也将有助于加深温度对水稻叶绿体发育分子作用机理的了解.
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（责任编辑：顾浩然）