【摘 要】
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目的外周血游离DNA(cfDNA)中KRAS等基因突变检测可用于肿瘤患者个体化医疗标志物分析,用于指导患者的治疗和预后。目前常规的DNA突变检测技术如常规PCR-桑格测序受限检测灵敏
【机 构】
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空军军医大学药学系生物制药教研室;
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目的外周血游离DNA(cfDNA)中KRAS等基因突变检测可用于肿瘤患者个体化医疗标志物分析,用于指导患者的治疗和预后。目前常规的DNA突变检测技术如常规PCR-桑格测序受限检测灵敏度而无法实现诸如癌症患者血浆或血清中的低频率DNA突变分析。复合低温变性(COLD)-PCR技术可在PCR扩增过程中富集低丰度的突变DNA序列。标准COLD-PCR对变性温度设置要求严格,通常只有极窄的0.5℃有效变性区间,这极大的限制了该技术在临床中的实际应用。本研究提出一种宽变性温度-COLD-PCR(Te-COLD-PCR)。方法 1.重组质粒ABW4146 M(Kras密码子12和13个突变体)与野生型DNA进行1%至20%不同比例稀释用于比较COLD-PCR和常规PCR-桑格测序法检测KRAS突变性能。2.利用NCBI在线引物设计软件设定PCR扩增区为98bp和256bp。3.利用定量PCR-熔体曲线分析确定两种PCR产物的实际Tm值以设定低温变性临界温度(Tc)值。4.每次调整Tc的变化值为0.3℃。结果 1.常规PCR-桑格测序的突变检测灵敏度为10%-20%。2.Te-COLD-PCR和COLD-PCR后进行桑格测序能检测到所有稀释度样品中的突变,灵敏度接近1%。较常规PCR提高了近10倍。2. COLD-PCR的Tc处于78.5±0.3℃。Tc临界温度区仅0.6℃。3. Te-COLD-PCR的总Tc达到2-3℃,可以显著提高稀有突变序列的富集成功率以及实现多点突变的共扩增。结论综上,研究表明Te-COLD-PCR技术较COLD-PCR有更宽的低温临界变性(Tc)窗口,因此具有更好的重复性和敏感性等优势,更有利于对诸如肿瘤患者外周血样本cfDNA中的稀有突变进行检测。
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