【摘 要】
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以灭活的无乳链球菌诱导后的吉富罗非鱼为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆出吉富罗非鱼sIgM全长并对其进行生物信息学分析.sIgM基因cDN
【机 构】
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广东海洋大学水产学院,广东 湛江 524088
【出 处】
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2013年环北部湾高校研究生海洋论坛
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以灭活的无乳链球菌诱导后的吉富罗非鱼为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆出吉富罗非鱼sIgM全长并对其进行生物信息学分析.sIgM基因cDNA全长为1921bp,开放阅读框(ORF)为1740bp,5端非编码区(5-UTR) 41bp,3端非编码区(3-UTR) 140bp,编码579个氨基酸.预测分子量(MW)为64.26ku,理论等电点(PI)为5.36.1-19个氨基酸为信号肽结构.系统进化树分析显示,吉富罗非鱼sIgM与牙鲆和军曹鱼的亲缘关系较近.sIgM基因有一个可变区(VH)、一个连接区段(JH)和四个恒定区,基本结构形式为Leader-VH-JH-CH1-CH2-CH3-CH4.利用RT-PCR技术对无乳链球菌诱导前后的吉富罗非鱼sIgM基因的组织分布状况进行分析,结果显示,在健康的罗非鱼体内,sIgM基因主要在罗非鱼头肾、脾脏、胸腺中表达,而经灭活的无乳链球菌免疫48h后,sIgM mRNA的表达量在所有组织中都发生上调.将罗非鱼sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为,37℃条件下,IPTG浓度为0.05mM时诱导4h蛋白表达量最大.纯化蛋白后,Western Blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达.
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