【摘 要】
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人类错配修复基因hMLH1 和hMSH2 基因种系突变是导致遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)发病的主要原因,在已检出突变中约三分之一为仅发生一个氨基酸改变的错义突变,其中大多数错义突变常常仅被发现,其病理性后果和功能意义尚不清楚,极大地限制了对HNPCC 发病机理的认识及其在遗传咨询和风险评估方面的应用.本研究我们采用体外错配修复实验首次对华人HNPCC患者中发现的2 种hMLH1 基因错义突
【机 构】
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宁夏医科大学基础医学院,银川,750004 宁夏医科大学医学科学研究所,银川,750004
【出 处】
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中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议
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人类错配修复基因hMLH1 和hMSH2 基因种系突变是导致遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)发病的主要原因,在已检出突变中约三分之一为仅发生一个氨基酸改变的错义突变,其中大多数错义突变常常仅被发现,其病理性后果和功能意义尚不清楚,极大地限制了对HNPCC 发病机理的认识及其在遗传咨询和风险评估方面的应用.本研究我们采用体外错配修复实验首次对华人HNPCC患者中发现的2 种hMLH1 基因错义突变(T117M、V384D)和3种hMSH2 基因错义突变(L390F、Q419K 和Q629R)的功能意义进行了准确定性.首先,利用定点突变技术构建了hMLH1 和hMSH2 错义突变真核表达载体,并将其分别转染至各自的基因缺陷型细胞株HCT-116 和LoVo 中,通过观察它们在转染细胞中的表达及其生物学效应,探讨体外瞬时转染系统作为错义突变功能定性细胞模型的可能.结果显示错义突变体MLH1-T117M 在HCT-116 细胞中不能表达,并影响了其配对物PMS2 基因的转录,极有可能是致病性突变.而V384D 错义突变,其蛋白表达与野生型相比没有明显差异,有可能是hMLH1 基因的一个多态性位点.体外错配修复实验我们以噬菌体M13mp2 野生型及突变型TGA(89),TCA(88,89)为材料构建了含有错配的异源双链DNA 底物作为待修复模板.利用Bac-to-Bac 昆虫细胞杆状病毒表达系统大量制备了野生型与突变体MLH1、MSH2以及PMS2 蛋白以及野生型与突变体异源二聚体MutLα 蛋白(MLH1-PMS2)以及MutSα 蛋白(MSH2-MSH6),配合优化的dNTPs,ATP 能量供给系统及必要的离子浓度,成功构建了体外错配修复功能分析模型,通过分析突变对错配修复能力的影响确定这些错义突变的致病性.结果表明,MLH1-T117M 完全缺乏对异源双链DNA 的修复能力,可以认为是致病性突变；而MLH1-V384D修复能力与野生型蛋白相等,被认为是hMLH1 基因的一个多态位点.MSH2-L390F 、MSH2-Q419K 的错配修复能力与野生型相比显著降低,据此认为它们应属于致病性突变；MSH2-Q629R 依旧保持了大部分的错配修复功能,故而被划分为非致病性基因多态性.
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