【摘 要】
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本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象,对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计,摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究,包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选,并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度
【机 构】
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四川大学生命科学学院,四川大学动物疾病防控生物工程研究中心,四川成都 610064 四川农业大学动物医学院四川 雅安 625014
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本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象,对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计,摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究,包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选,并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较,对碱裂解法进行优化,对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究,再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份,为12g/L胰蛋白胨,4g/L酵母提取物,10g/L葡萄糖,6ml/L甘油,3g/L NaCl,8g/L Na2HPO4,3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件,为接种量5%、温度42℃、pH7.2、D050%。建立了以碱裂解法粗提,硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质,提取的质粒DNA纯度可达到1.88,超螺旋比例达到98.4%,符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较,生产成本降低了20-40%。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本,为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。
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