【摘 要】
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本研究前期克隆获得木聚糖酶基因xynHB,可以在毕赤酵母中表达,表达的重组酶发生了糖基化,在60℃半衰期只有12min.本研究将该基因编码产物的214位糖基化位点氨基酸N突变为
【机 构】
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湖北大学生科院 武汉 430062
【出 处】
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第七届中国工业生物技术发展高峰论坛
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本研究前期克隆获得木聚糖酶基因xynHB,可以在毕赤酵母中表达,表达的重组酶发生了糖基化,在60℃半衰期只有12min.本研究将该基因编码产物的214位糖基化位点氨基酸N突变为A,突变体基因命名为xynHBn3,突变体在毕赤酵母表达的重组酶在60半衰期由12min提高到65min.为了证明热稳定性提高是糖基化的原因还是氨基酸发生突变的原因,我们又将原始基因和突变体基因在大肠杆菌进行了表达纯化,结果显示突变体在60℃处理30分钟的热稳定性比原始基因提高了50％.将该突变体按照毕赤酵母的密码偏爱性,进行密码优化后进行全合成,合成的基因连接毕赤酵母表达载体后转到毕赤酵母,用交联木聚糖平板筛选水解圈最小的转化子作为含有单拷贝木聚糖酶基因的转化子.发酵培养该重组菌株,与含有未经序列优化基因的原始重组菌株相比,摇瓶发酵上清的酶活比原始木聚糖酶活性提高39.5％.最后利用平板活性筛选,获得了摇瓶酶活大于2000U／ml的重组木聚糖酶.该重组木聚糖酶热稳定性和酶活较高,酶最适作用温度为40-60℃,最适作用pH值为6-9之间,分子量小、不含纤维素酶、耐螯合剂EDTA.以纯草浆和木苇混合浆为材料,进行助漂小试,结果显示,添加15U木聚糖酶／克绝干浆,可提高纸张白度10-20％,耐破指数10％以上.木聚糖酶热稳定性的提高和高产工程菌株的构建
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