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玉米大斑病(northern corn leaf blight,NCLB)是由大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)引起的一种严重叶枯性病害.据报道,在该病严重流行年份和地区,常造成玉米大面积减产,直接影响玉米的产量和品质,造成严重的经济损失.深入研究病菌致病性的分子调控机制、寻求有效杀菌剂的作用靶标是防治该病的有效手段之一.利用基因同源重组原理实现靶基因敲除技术,是目前广泛采用的研究未知基因功能的有效方法.但目前的研究发现,该技术转化效率极低,限制了特定基因打靶技术的快速发展.在植物病原真菌中研究发现,KU80基因是进行DNA双链断裂修复非同源末端连接所必不可少的,将KU80基因敲除后,外源DNA片段的非同源整合频率显著降低,使靶基因敲除效率显著提高.本研究从SGD网站(http：//www.yeastgenome.org/)上,搜索获得了酵母YKU80基因的蛋白质序列,通过在玉米大斑病菌蛋白数据库中比对,得到了玉米大斑病菌中YKu80的同源蛋白,其相应的基因命名为StKU80.StKU80基因全长为2 439bp,cDNA全长为2 199bp,编码732个氨基酸,含有5个外显子和4个内含子.我们进一步以pBS质粒为基本质粒,并分析StKU80基因编码区序列上游侧翼序列1 000bp和下游侧翼序列1 000bp及草铵膦抗性基因Bar的酶切位点图谱,使用Primer5.0软件设计引物,并在引物的5’末端引入Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Xba Ⅰ酶切位点,扩增得到了StKU80基因上、下游同源基因片段和草胺膦基因.将它们和质粒用上述限制性内切酶进行酶切和连接,构建得到了StKU80基因的敲除载体.在随后的试验中,我们已经利用聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化技术得到2株具有草胺膦抗性的菌株,在后续试验中拟利用特异引物PCR、RT-PCR、Southern blotting等技术确定StKU80靶基因敲除突变体,通过比较StKU80基因敲除突变体和野生型在生长发育及致病性等方面的差异明确该基因的功能.该研究不仅能明确玉米大斑病菌StKU80基因的功能,而且可为构建以StKU80敲除突变体为受体菌株的高效靶基因敲除平台奠定基础.