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本研究以基因敲除技术为基础,来研究TgCPB基因的部分生物学特性。利用PCR扩增技术,从弓形虫基因组上扩增TgCPB基因5’非编码区(CPB5’-UTR/1709bp)和3’非编码区(CPB3’-UTR/1810bp),将其分别克隆入载体质粒pBluescript中,将phle基因也克隆入pBluescript中,构建5’UTR-T-pBluescript-3’UTR-phle转染质粒。酶切鉴定结果表明成功构建了5’UTR-T-pBluescript-3’U/TR-phle质粒。经DNA测序分析,与Genebank上刊登的弓形虫基因组序列的同源性为100%。NotI酶切线性化重组质粒,得到条带为8088bp的线性质粒,电穿孔转染入弓形虫体内,同源重组整合入弓形虫基因组中,阳性克隆因含有抗性基因而能在抗性筛选培养基中生长,未整合的虫体及阴性对照则死亡,经抗性筛选1月左右,获得弓形虫TgCPB缺失株。经PCR鉴定,缺失株成功扩增出前后臂分别为2134bp和2552bp目的条带。根据缺失掉的3238bp基因组序列,设计Southern杂交探针引物,经过Southem-blotting鉴定,TgCPB缺失株无条带,GT1野生株有条带,两个实验均证明缺失株筛选成功。应用间接免疫荧光实验检测TgCPB缺失后弓形虫粘附、入侵宿主细胞的能力。粘附实验结果表明,缺失TgCPB基因后,弓形虫粘附宿主细胞的能力没有明显变化,表明该基因可能不直接参与弓形虫粘附宿主细胞的过程。入侵实验表明,缺失TgCPB基因后,虫体入侵宿主细胞的能力也没有明显改变。利用间接免疫荧光实验检测缺失TgCPB基因后,弓形虫在宿主细胞内的增殖情况,实验结果表明,缺失TgCPB基因后,弓形虫在宿主细胞内的增殖能力明显减弱。另外,利用荧光定量PCR的方法对虫体增殖情况进行检测,结果显示,缺失TgCPB基因后,弓形虫在细胞内的增殖速度显著减慢,与免疫荧光实验相符,提示该基因可能为弓形虫的一种新型毒力基因,可能参与弓形虫的致病机理。本实验还应用流式细胞术技术对缺失株及野生株进行细胞周期检测,结果显示GT1组S期百分数是35.13±1.84,CPB组是53.03±1.87。这表明,TgCPB缺失株组提前进入S期,且S期持续时间较长,说明缺失TgCPB基因后,TgCPB比GT1更早的进入了生长的平台期,降低了虫体在一定时间内生长量的积累,也可以说缺失TgCPB基因后不利于弓形虫的增殖,实验结果与荧光定量PCR结果相符。基于荧光定量PCR及流式细胞术实验结果,推测TgCPB基因可能为一种致病基因。实验中将弓形虫与巨噬细胞共培养,应用Griess法对细胞培养上清NO的含量进行检测,结果显示,缺失TgCPB基因后NO的表达量明显增高,利用生物软件进行分析,与GT1野生株组相比差异极显著,表明TgCPB基因可能在弓形虫介导的信号通路中起到关键的作用。另外,本论文还对TgCPB基因进行了虫体定位分析,根据ToxoDB中登陆的TgCPB编码区序列,设计并合成一对引物,利用原核表达实验,表达重组蛋白PET-22b-CPB-DE3。SDS-PAGE及、Vestem-blotting实验均出现62.5kD的蛋白条带,表明成功获得重组蛋白且该蛋白具有一定的反应原性。经镍柱法纯化蛋白,免疫小鼠,制备多克隆血清,应用免疫荧光实验进行TgCPB蛋白的虫体定位分析,结果表明,TgCPB蛋白定位于弓形虫虫体两端或表面。该实验成功获得TgCPB缺失载体及单克隆虫株,通过对其部分生物学特性的研究发现,TgCPB基因的缺失对其正常的生命活动产生了重要的影响,为弓形虫病的防治提供依据。