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背景:卡介苗(BCG)是目前唯一的被国际公认并广泛使用的结核病预防疫苗,现已明确其可有效预防儿童重症结核病,但对成人结核病预防效果差。我们前期分别构建过表达结核分枝杆菌保护性抗原Ag85A、Ag85B或HspX的重组卡介苗rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X,并经动物实验证实,均可改善BCG对结核病的预防效果。目的:本研究结合国内、外法规要求以及菌株构建特点,旨在建立三株重组卡介苗rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X的种子批以及针对种子批的检定方法。方法:在含有卡那霉素的7H11固体培养基分离不同株细菌的单菌落,挑选单菌落接种含卡那霉素的7H9液体培养基增菌和传代,建立不同株细菌的种子批以及连续传代至第六代次。以市售BCG疫苗为对照,将不同株细菌分别接种于7H9液体培养基,每两天测定菌液的OD600nm并绘制细菌的体外生长曲线;普通PCR扩增不同株细菌基因组DNA的不同靶基因区,鉴定细菌的基因型;逆转录荧光定量PCR技术(RT-qPCR)鉴定Ag85A、Ag85B或HspX的mRNA在不同株细菌种子批的相对表达水平以及证实传代培养对表达的稳定性的影响。结果:三株重组卡介苗在7H11固体培养基上生长良好,菌落干燥、皱缩,呈淡黄色,细菌抗酸染色为阳性;接种7H9液体培养基生长良好,菌体沉于培养基底部,抗酸染色为阳性;培养特征与市售BCG无明显区别。三株重组卡介苗的体外生长曲线近S型,与市售BCG无区别。三株重组卡介苗的基因组,均有约10kb RD2区缺失和约60kb DU2重复区内部缺失,存在RD14区、RD15区和DU2-Ⅳ重复区,不存在DU2-Ⅰ重复区和DU2-Ⅲ重复区,均与市售BCG的基因型特征一致,属于BCG Danish株。RT-qPCR鉴定Ag85A、Ag85B或HspX的mRNA在相应的rBCG菌株种子批的表达水平,相对于市售BCG均增加至少5倍;且传代对靶抗原编码基因的表达水平无影响。结论:成功建立了重组卡介苗种子批和检定方法,为申报临床试验奠定了基础。