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目的:表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ。
方法:用PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表达载体pIRES-FⅦ,转化感受态大肠杆菌细胞后,筛选阳性重组菌落,提取重组质粒DNA,测序正确后用脂质体介导的方法转染BHK-21细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释等方法获得克隆细胞株,收集浓缩无血清培养上清,进行SDs-PAGE、Western blot和活性鉴定。
结果:成功构建了重组表达载体pIRES-FⅦ,实现了其在BHK-21细胞中的表达。SDS-PAGE和westem blot鉴定结果表明,表达产物中有凝血因子Ⅶ的存在,且表达产物具有促凝活性。
结论:在哺乳动物细胞中成功表达了重组人凝血因子Ⅶ,为整体止血剂的研究奠定了基础。