<正>目的:为改善抗体基因的扩增效率及多样性,优化设计一套针对BALB／c小鼠的Ig重链Fd片段和轻链基因的新简并引物,并对pComb3噬粒载体进行相应改造。方法:基于最新版Kabat数据库巾的小鼠已知Ig抗体功能可变区基因,用Kabatman提取Fd、Lκ的FR1区5,端保守氨基酸序列并对其家族进行重新分组,同时参照前人设计的Fab 3,端引物,优化设计特异性的新的鼠源性Fab抗体库引物。利用Seqhunt Ⅱ分析优化后引物的实际匹配情况,并与前人设计的Fab引物的匹配情况进行对比。通过PCR扩增和建库后随机克隆测序,对优化引物的实际扩增效率及扩增的抗体基因多样性进行鉴定。针对新设计的Fab引物的克隆位点,将pComb3上待突变片段重组入T载体后,利用设计的二套反向毗邻引物进行定点突变扩增。酶切验证后将突变片段重新连回pComb3,对改造后的pComb3载体进行一系列酶切鉴定和测序验证。结果:重新分类建立了小鼠Ig抗体23个Fd基因家族、25个Lκ基因家族。发现MfeI代替Xho1作为Fd 5,端引物的酶切位点对BALB／c小鼠更为合适。优化设计后的Fd 5,端的扩增引物有10条,3,端有4条。优化后的Lκ5,端扩增引物有7 条,3,端有1条。优化后的Fd、Lκ5,端引物与小鼠已知Ig基因可变区基因完全匹配率分别达92％、 88％(与酶切位点后的碱基序列比对)和75％、60％(与酶切位点外的碱基序列比对)。与传统设计的Fab引物相比,优化后的引物数目合适、简并性适中、匹配率(错配少于3个碱基时)最高。 PCR扩增的结果显示,优化后的引物配对均能从不同免疫方案免疫的小鼠脾中分别高效、特异性的扩增出符合预期大小的抗体Fd、Lκ片段。DNAPLOT对10个随机克隆的测序结果分析显示,所扩增的抗体基因与小鼠胚系基因同源性≥83%,Fd亚型主要为IgG1、IgG2a,对应的胚系基因家族分布数有5种,Lc亚型均为κ型,对应的胚系基因家族分布数有7种。对二种定点突变过的pComb3M 载体酶切鉴定和测序结果显示,MfeI酶切位点已成功引入pComb3载体的重链基因克隆位点,原有的抗体基因克隆位点及其它酶切点均无改变(除克隆1的Xho1位点丢失外)。结论:基于小鼠Ig 抗体功能可变区基因而优化设计的Fab抗体库引物,可以提高抗体基因的扩增效率及多样性,与之相配套的pComb3载体的成功改造,为高容量、多样性鼠源性噬菌体Fab抗体库的构建奠定了较好的载体-引物系统。