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研究背景:杜氏型肌营养不良症又称假肥大型肌营养不良症,是目前最常见的一类进行性肌营养不良症,主要是男性发病,女性为致病基因的携带者,患病率约为1/3500男婴,属于X-连锁隐性遗传,发病年龄通常为3-5岁左右。本病是由于编码抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)的DMD基因的突变所引起,该病患者通常在3岁左右开始逐渐出现站立和行走困难、动作笨拙等症状,随着病变的进展,患儿双侧腓肠肌逐渐呈假性肥大,腱反射减弱或消失,病变呈进行性加重,常到10岁时已不能行走,在20岁-30岁左右因呼吸衰竭而死亡。现阶段用于治疗DMD药物大多是一些激素药物如糖皮质激素,这些激素药物虽然可以在一定程度上延缓该病的发展速度,但长期服用会有一些如发胖、骨质疏松以及生长抑制等明显不良反应,虽然目前一些基因疗法(如外显子跳跃治疗、无义突变通读治疗和腺相关病毒介导治疗)在临床试验中取得了一定成果,但是尚无有效的治愈方法。研究目的:腺相关病毒介导抗肌肉萎缩基因治疗是指通过腺相关病毒载体将抗肌肉萎缩基因导入宿主体内,从而使抗肌肉萎缩基因在宿主细胞内表达并产生抗肌肉萎缩蛋白。Utrophin作为Dystrophin的同源蛋白,与Dystrophin有着相似的结构和功能,前期已有研究表明Utrophin可代偿Dystrohpin的功能,只要加强这种蛋白质的表达或促进编码该蛋白的基因转录,就有可能补偿或部分补偿Dystrohin的功能,从而延缓肌营养不良病程的进展。本研究探究利用腺相关病毒(r AAVs)介导优化的mini-Utrophin的基因疗法对mdx小鼠(DMD小鼠模型)肌肉力量、肌肉形态、功能以及血清肌酸激酶等方面的生理变化,本研究结果将给罕见病DMD儿童带来希望,增加结束"杜氏"的可能性。研究方法:(1)设计携带mini-Utrophin的AAV相关病毒载体;(2)选取20只出生7-10天的mdx小鼠,随机分为处理组(10只)和未处理组(10只),另选取10只出生7-10天的野生型小鼠(c57bl/10scsn小鼠)作为对照组,对处理组mdx小鼠进行腹腔注射含有mini-Utrophin的AAV相关病毒载体,对未处理组mdx小鼠注射PBS缓冲液。注射6周后对处理组mdx小鼠与未处理组mdx小鼠以及对照组进行形态学、肌肉生理学、分子生物学等一系列比较与评价。研究结果:(1)处理组小鼠注射6周后,采用荧光染色和Western Blot方法检验显示:处理组mdx小鼠横纹肌上的mini-Utrophin高度表达,与注射PBS的未处理组小鼠形成鲜明对比;(2)处理组mdx小鼠缺失的跨膜肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)重新被招募。杜氏型肌营养不良症是由于Dystrophin蛋白的缺失使DGC结构的完整性受到破坏,部分跨膜信号传导通路异常,造成肌细胞膜不稳定,肌肉收缩时出现各种机械因素的损伤,从而导致的肌纤维坏死和功能缺失而发病。处理组mdx小鼠的mini-Utrophin表达水平足以稳定DGC结构;(3)DMD患者由于dystrophin蛋白的缺失导致肌纤维坏死,从而使大量的肌酸激酶从肌细胞释放入血液,使血清中的CK值明显升高,因此用血清中肌酸激酶的含量可以预测肌纤维的坏死程度。通过对比处理组、未处理组以及对照组小鼠的血清,发现处理组mdx小鼠的血清肌酸激酶恢复至正常水平,与对照组小鼠无显著差异,而未处理组mdx小鼠的血清肌酸激酶水平明显高与其他两组;(4)对所有小鼠进行连续离心收缩力测试后,发现未处理组mdx小鼠的离心收缩力下降百分比明显高于处理组与对照组,处理组mdx小鼠与对照组小鼠的离心收缩力下降百分比无显著差异;(5)处理组小鼠病理肌纤维消失,说明处理组mdx小鼠的肌肉组织损伤得到了完全的抑制,肌肉能力恢复到正常水平。研究结论:(1)腺相关病毒介导的mini-Utrophin基因可在mdx小鼠骨骼肌中成功表达;(2)腺相关病毒介导的mini-Utrophin基因在mdx小鼠体内表达后可恢复mdx小鼠的病理肌纤维;(3)腺相关病毒介导的mini-Utrophin基因可降低mdx小鼠的血清肌酸激酶水平至正常水平;(4)腺相关病毒介导的mini-Utrophin基因在体内的表达可恢复mdx小鼠骨骼肌功能;(5)通过比较腺相关病毒介导的mini-Utrophin/Dystrophin对DMD小鼠的肌肉形态以及其它生理功能的影响,为治疗杜氏型肌营养不良症提供了新思路。