【摘 要】
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Protein A含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域.将Protein A偶联至基质上(如琼脂糖和聚合物微球等),可以与抗体特异性结合,选择性极高.通常用作于单克隆抗体纯化,近年来Protein A亲和层析也迅速成为抗体药物制备的关键步骤.在选择Protein A层析介质时,选择高载量的Protein A介质是降低成本、提高纯化效率的明智选择.此外,考虑到抗体药物生产的要求,在
【机 构】
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中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室
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Protein A含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域.将Protein A偶联至基质上(如琼脂糖和聚合物微球等),可以与抗体特异性结合,选择性极高.通常用作于单克隆抗体纯化,近年来Protein A亲和层析也迅速成为抗体药物制备的关键步骤.在选择Protein A层析介质时,选择高载量的Protein A介质是降低成本、提高纯化效率的明智选择.此外,考虑到抗体药物生产的要求,在操作中经常需要对Protein A介质进行在位清洗(Clean in Place,CIP),以便去除残留在层析介质上的杂质蛋白、脂类和核酸,因此,制备出一款高载量、耐碱型的Protein A抗体层析介质迫在眉睫.以琼脂糖微球为基质的层析介质在制备过程中接枝葡聚糖被发现可以很好的提升介质载量和稳定性.本研究采用Sepharose 4FF环氧活化后,再与葡聚糖溶液(T40)反应,得到葡聚糖接枝型琼脂糖微球,采用环氧氯丙烷对基质进行活化,通过调节蛋白溶液的pH值和温度偶联耐碱型Protein A配基得到葡聚糖接枝型高载量抗体介质.测定该介质载量,考察其耐碱性能,通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察抗体在Protein A介质中的分布情况来探究葡聚糖接枝对Protein A的吸附抗体的促进机制.本研究制备的葡聚糖接枝型Protein A介质对IgG的动态结合载量较常规Protein A介质提高了22％.且能达到MabSelect SuRe载量的95％.在进一步的探究中,采用0.5M NaOH对葡聚糖接枝型Protein A柱进行CIP清洗,经过40次循环,对抗体仍能保持92％以上动态结合载量.层析谱图与初始基本一致,介质理化性质无变化.本研究还利用激光共聚焦显微镜观察Protein A介质对抗体的吸附随时间的变化情况.随着保留时间的延长,抗体FITC-IgG基本可以结合在整个葡聚糖接枝型Protein A介质中,而常规及MabSelect SuRe 介质,直到达到吸附饱和,IgG也只能分布在介质的外周,验证了葡聚糖接枝对Protein A的吸附抗体的促进.最后,采用原子力显微镜对葡聚糖接枝型Protein A介质微观表面形态进行观察,葡聚糖接枝后的介质表面的高度会明显高于常规的介质.
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