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【研究背景】植酸,即肌醇六磷酸,主要沉积在植物的种子中,不仅不能被人畜禽等单胃动物所消化,而且其携带的超多负电荷影响动物对营养的吸收。早在1992年美国就提出了作物的低植酸育种。然而,种子中的植酸不仅仅只有"过",也还有"功"。因此,当把低植酸作为育种目标时,有可能给种子发育带来不利影响。1,3,4,5,6-五磷酸肌醇2-激酶(IPK1)是催化植酸合成最后一步反应的关键酶,在水稻基因组中单拷贝存在。本文利用CRISPR/Cas9技术对水稻IPK11基因进行编辑,以期获取低植酸水稻新品种,为后期研究植酸降低对水稻自身及以稻米为食动物发育的影响提供基础。【材料与方法】所用水稻品种为天津市水稻研究所赠送的粳型常规水稻"金粳818"。CRISPR/Cas9系列载体由英国JohnInnes Centre的Cristobal Uauy教授馈赠。依据水稻IPK1基因的结构、序列及服务器所得的参数,确定了2条sgRNA。载体的构建采用GoldenGate方法。构建了sg67单表达、sg41单表达及sg67/sg41双表达的CRISPR/Cas9载体。基于实验室之前报道的"日本晴"成熟胚体系优化了"金粳818"植株再生体系。利用农杆菌介导的方法获得基因编辑植株。利用PCR方法检测植株中是否含有CRISPR/Cas9片段,并对其DNA进行靶位点PCR产物的测序。【结果与分析]优化"金粳818"分化培养基实验发现,添加5B/2N(5 mg/L6-BA+2 mg/LNAA)愈伤组织的变绿率及成苗率最高,分别为80.7%和48.0%;4B/1N的成苗率虽稍低于5B/2N,为38.0%,但丛芽、白化苗的比例更低。因此,后续以4B/1N进行"金粳818"不定芽分化。采用农杆菌介导的方法,共获得42株再生幼苗,其中15株白化苗、27株绿色苗。对T0代植株PCR,检测发现,40株含有CRISPR/Cas9的扩增序列,阳性率高达95%。对26株绿色转化株进行扩增片段测序发现,编号为E12-1的sg67/sg41转化株在sg41靶点附近突然发生了错峰现象。克隆测序发现,3个为野生型序列,4个发生了3个碱基的缺失,3个在sg41靶点或其PAM附近发生了碱基替换。缺失与非缺失比为4:6,接近1:1,表明sg41的缺失为杂合型。由于缺失的碱基数为3的倍数,且位于开放阅读框的第212-第214碱基,因此导致了2个氨基酸突变(第71位和第72位)。亚克隆测序还发现,3个亚克隆子(3/10)发生了单碱基替换,其比例远高于正常PCR的突变频率,且位于sg41靶点或其PAM附近,怀疑其是由染色体DSB引起的。【结论】本研究获得了水稻低植酸的新种质,但利用该载体系统进行敲除的效率较低,是否间接证实低植酸育种具有风险尚需进一步证实。另一方面,IPK1编辑效率低的另一个原因也许与利用卡那霉素进行筛选有关。