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背景 骨髓增殖性肿瘤(MPNs)包括原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(PMF)、真性红细胞增多症(PV)等疾病.2008年修订的WHO骨髓增殖性肿瘤诊断指南中,已经将JAK2 V617F突变纳入诊断标准.然而,在随后的研究中发现,在相当一部分未发生JAK2 V617F突变的ET和PMF患者体内存在另一种可导致疾病发生的突变基因—MPL,编码了促血小板生成素受体.该基因第5 15个氨基酸残基W恰好位于MPL唯一的跨膜区胞质区铰链区交叉区域.MPL515W有两种突变：W515L (TGG＞TTG)和W515K(TGG＞AAG),如果发生突变,将自发性激活信号通路,该突变已经成为诊断ET和PMF的分子标志物.目前用于检测MPL515W突变的方法有DNA测序、荧光探针PCR、突变特异性扩增系统(ARMS)等方法.但测序检测周期较长；荧光探针PCR需要合成较为昂贵的探针；ARMS需要电泳,容易造成污染,而且不具备在一次反应中同时检测2种突变的功能.目的 建立一种可灵敏、快速、准确地且能同时检测MPLW515L和MPLW515K突变的一步法,以方便在临床上使用.方法 挑选261例ET和25例PMF患者,利用非标记探针高分辨熔解曲线的方法,设计一种与515W完全匹配的探针(不偶联荧光基团),根据515L、515K与探针结合时,由于碱基的差异会产生明显不同熔解温度(Tm)的特性,实现以一种探针同时检测MPLW515L和MPLW515K突变的目的.人工制备515W、515L和515K质粒作为阳性对照,挑选部分标本测序验证结果.同时,使用SYBR Green I荧光定量PCR检测JAK2 V617F突变.结果 熔解曲线图的左侧是探针/产物形成的熔解峰,MPL515W的Tm峰出现于(76.4±0.1)℃处,,MPL515L出现于(72.4士0.1)℃,MPL515K出现于(69.5±0.3)℃.根据这三处是否出现熔解峰判断突变类型.测序结果与非标记探针结果一致.261例ET样本中有5例(1.92％)只有L阳性,1例(0.38％)只有K阳性,1例(0.38％)同时出现L和K阳性,其中仅存在K突变的标本同时检测到JAK2 V617F突变；25例PMF样本中有1例(4％)只有L阳性,2例(8％)同时出现L和K阳性,这3例MPL515M突变阳性样本未检测到JAK2 V617F突变.结论 JAK2 V617F突变在真性红细胞增多症中有较高的检出率(88.9％),但在其他类型MPNs中检出率并不高.MPLW515L/K的发现,弥补了JAK2 V617F在PMF、ET患者中阳性率较低的遗憾.本研究中 PMF患者的MPLW515L/K突变总阳性率达到12％,在ET中阳性率达到2.68％,略高于国外报道的4％～9％和1％.并且在10例MPLW515L/K突变样本中,仅1例同时伴有JAK2 V617F突变,可以作为JAK2 V617F的补充检测手段.本次研究采用自行设计的未标记荧光的特异性探针,可以清晰、简便地在一次PCR中区分出 W、L、K三种基因型,简化了实验步骤,缩短了检测时间,并且价格低廉、无污染,非常适合临床使用.