【摘 要】
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目的:肿瘤、外伤等原因引起的骨缺损一直困扰着许多骨科和口腔医生,但炎症感染的因素同时也对机体存在影响。过度的急性炎症反应,和未被规范处理的急性炎症反应转变为长期慢性炎症,会刺激破骨细胞生成,损害干细胞的成骨分化功能,导致骨形成/骨吸收两者关系失衡,引起骨愈合不良。近期本课题合作者研发了一类具有手性杂环结构的化合物,具有较好的抗炎活性及较低毒性。因此本课题探索通过添加手性杂环化合物（Chiral h
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目的:肿瘤、外伤等原因引起的骨缺损一直困扰着许多骨科和口腔医生,但炎症感染的因素同时也对机体存在影响。过度的急性炎症反应,和未被规范处理的急性炎症反应转变为长期慢性炎症,会刺激破骨细胞生成,损害干细胞的成骨分化功能,导致骨形成/骨吸收两者关系失衡,引起骨愈合不良。近期本课题合作者研发了一类具有手性杂环结构的化合物,具有较好的抗炎活性及较低毒性。因此本课题探索通过添加手性杂环化合物（Chiral heterocyclic compounds,CHC）,降低炎性因子对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的影响,恢复干细胞成骨分化功能,为炎性骨缺损的再生提供一种新的方法。方法:以体外培养的BMSCs为对象,加入大肠杆菌来源的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）构建细胞炎性模型,将不同浓度的LPS(0、0.5μg·m L-1、1μg·m L-1、2μg·m L-1、5μg·m L-1、10μg·m L-1)分别加入BMSCs的培养基中,分别培养不同时长（1 d、3 d、5 d、7 d）,利用CCK-8检测其对细胞活性的影响。根据CCK-8结果,将不同浓度的LPS(0、0.5μg·m L-1、1μg·m L-1、2μg·m L-1)分别加入BMSCs的培养基中,分别培养不同时长（1 d、2 d、3 d）,利用RT-PCR检测其TNF-ɑ、IL-1β、IL-6基因的表达水平,验证不同浓度LPS及不同LPS作用时间对BMSCs的影响。利用CCK-8、ELASA、RT-RCR方法,从五种CHC（CHC-A、CHC-B、CHC-C、CHC-D、CHC-E）中综合筛选出具有明显抗炎作用的化合物,将其作用于炎性BMSCs模型,分别培养7 d、14 d、21 d,利用RT-PCR技术检测成骨基因RUNX2、ALP、OCN、COL1A1的表达水平、碱性磷酸酶染色实验检测ALP活性、茜素红染色实验检测钙结节的形成,以及免疫荧光技术检测RUNX2、OCN、COL1A1蛋白的表达,从而验证CHC在炎性条件下促进BMSCs成骨分化的能力。结果:实验结果显示高于1μg·m L-1的LPS会对BMSCs的活性产生抑制,LPS的浓度越高,抑制作用越明显,随着LPS的作用时间增加,细胞活性受到的抑制也越明显。LPS作用会使BMSCs炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平升高,随着LPS作用时间增加,LPS浓度越高,炎性因子的表达水平升高越明显。同时LPS作用下,BMSCs的成骨基因RUNX2、ALP、OCN、COL1A1的表达水平有明显下降,钙结节数量减少,碱性磷酸酶染色减少。将五种CHC加入炎性BMSCs的培养基中,CCK-8、RT-PCR、ELASA结果显示,其中CHC-C具有最佳的抗炎活性。将10μmol·L-1CHC-C作用于炎性BMSCs,检测结果显示炎性因子相关基因和蛋白表达水平明显降低,成骨基因和蛋白的表达水平升高,茜素红染色、碱性磷酸酶染色面积增加。结论:LPS作用于BMSCs可成功构建BMSCs细胞炎性模型,1μg·m L-1及以下浓度的LPS对BMSCs细胞活性无明显影响,但随着LPS浓度升高,对细胞活性产生抑制,随着LPS作用时间增长,抑制作用增加。同时LPS作用会降低BMSCs的成骨分化功能。CHC-C具有良好的抗炎活性,可以抑制炎性因子表达,恢复炎性干细胞的成骨分化功能。因此,本课题通过CHC的抗炎和促成骨分化研究,为炎性骨缺损治疗提供一种新的治疗方法。
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