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第一部分Lnc RNA E2F3SR在视网膜母细胞瘤中的作用机制研究研究目的和意义:视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤,占儿童全部恶性肿瘤的4%,我国每年新病例约有1500人,占全世界每年新病例的20%。Rb可导致患儿失明、眼球丧失甚至死亡,严重威胁患儿身心健康。从分子水平认识RB的发生、发展规律,对抑制肿瘤的生长、转移和提高患儿的生存率,具有重要的临床意义。长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在肿瘤表观遗传、转录以及转录后调控等多方面调控基因表达,具有重要的生物学功能,其异常表达常与肿瘤等疾病密切相关。前期研究发现E2F Transcription Factor 3 self-regulated RNA(E2F3SR)是表达于细胞周期调控关键基因E2F Transcription Factor 3(E2F3)内含子区域的长链非编码RNA,其在视网膜母细胞瘤中的表达丰度显著升高,提示其可能在视网膜母细胞瘤的发生发展过程中发挥重要调控作用,然而E2F3SR在视网膜母细胞瘤中的作用机制尚不清楚。本研究试图通过体内和体外实验探究E2F3SR对视网膜母细胞瘤的影响,探讨E2F3SR与视网膜母细胞瘤临床特征和患者预后的关系,揭示其在肿瘤发生发展中发挥关键作用的分子机制。为视网膜母细胞瘤的临床治疗提供新的思路和新的方法。研究内容和研究方法:1.运用生物信息学(TCGA、GEO、GEPIA数据库)和相应的统计学方法分别分析E2F3SR在各类临床肿瘤中的表达量以及其与视网膜母细胞瘤病人生存预后关系;2.利用Realtime PCR检测视网膜母细胞瘤及其细胞系Y79、WERI-Rb-1和正常视网膜色素上皮以及细胞系ARPE-19中长链非编码RNA E2F3SR的表达水平;3.通过荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、核质分离实验明确E2F3SR亚细胞定位,通过c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)确定E2F3SR转录本的真实全长;4.构建E2F3SR干扰质粒,利用慢病毒转染系统建立稳定干扰E2F3SR的视网膜母细胞瘤细胞系sh E2F3SR-Y79、sh E2F3SR-WERI-Rb-1及其空载对照细胞系;5.分别采用CCK8试剂检测、克隆形成实验、软琼脂实验、细胞周期检测等方法观察干扰E2F3SR后视网膜母细胞瘤细胞在体外的增殖和存活能力是否受到影响,并将sh E2F3SR-Y79及其对照细胞分别进行裸鼠眼部原位成瘤实验,观察干扰E2F3SR对视网膜母细胞瘤细胞体内增殖能力和成瘤能力的影响;6.通过RNA纯化的染色质分离技术(Chromatin Isolation by RNA Purification,Ch IRP)联合蛋白质质谱分析技术(Mass Spectrometer,MS),寻找与E2F3SR特异性结合的功能蛋白或者多肽,通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)验证目的蛋白与长链非编码RNA E2F3SR结合的有效性;7.将视网膜母细胞瘤E2F3SR干扰细胞系sh E2F3SR-Y79、sh E2F3SR-WERI-Rb-1及其对照细胞系进行表达谱芯片检测,分析其下游潜在靶基因,并通过染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation Assay,Ch IP)验证功能蛋白与靶基因结合的区域,推测其促进视网膜母细胞瘤发展的分子机制。研究结果:1.通过对TCGA、GEO、GEPIA数据库数据统计分析,发现在视网膜母细胞瘤中,E2F3SR表达水平显著增高且E2F3SR越高的患者预后越差;2.从转录组水平证实E2F3SR在视网膜母细胞瘤及其细胞系中表达量显著高于正常组织及正常对照细胞系;3.E2F3SR在肿瘤细胞中定位于核内,其在视网膜母细胞瘤中的核酸长度为451bp,与数据库(UCSC、Ensembl)中略有不同;4.通过CCK8、克隆形成、软琼脂实验、流式细胞周期检测以及裸鼠视网膜母细胞瘤眼球原位成瘤实验发现,与对照组相比,干扰E2F3SR表达后视网膜母细胞瘤细胞生长、增殖变慢,细胞周期受到明显阻滞,眼球成瘤能力明显减弱。5.Ch IRP实验发现E2F3SR在视网膜母细胞瘤中与可变剪切因子(hn RNP L)特异性结合,RIP实验进一步证实了两者结合的特异性。6.表达谱芯片数据分析结果提示与E2F3SR同样位于6号染色体短臂2区2带3亚带(6p22.3)的细胞周期关键基因E2F3为其潜在靶基因,Ch IP实验证实在视网膜母细胞瘤中干扰E2F3SR的表达使hn RNP L在E2F3基因启动子区域的结合显著减少,其启动子活性明显降低,E2F3基因表达量在转录水平和翻译水平均显著降低;研究结论:E2F3SR在视网膜母细胞瘤中表达升高且其表达水平与肿瘤患者临床预后密切相关,E2F3SR高表达预示着RB的预后不良。E2F3SR可以促进肿瘤细胞增值、加快细胞周期,在视网膜母细胞瘤中发挥促癌作用。E2F3SR在细胞核内与可变剪切因子(hn RNP L)特异性结合,并将hn RNP L这一对启动子有促进活性的功能蛋白招募至位于同一转座子区域细胞周期关键基因E2F3的启动子区域从而激活E2F3的转录和表达,E2F3基因的高表达加快了肿瘤的细胞周期,促进了视网膜母细胞瘤的进展。E2F3SR既是E2F3基因座的产物又是影响E2F3的上游分子,在视网膜母细胞瘤中发挥染色体局部的正反馈调节功能,干扰E2F3SR的表达能破坏肿瘤中特有的正反馈机制,有望作为视网膜母细胞瘤的的预后判断指标和潜在的临床治疗靶点。第二部分 miR-181b在视网膜母细胞瘤中的作用机制研究研究目的和意义:微小RNA181b(micro181b,miR-181b)已经被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关。我们前期研究成果证实了miR-181b在视网膜母细胞瘤中(uveal melanoma,UM)中的促癌机制。前期研究发现miR-181b在Rb中表达量同样异常升高,是促进Rb生长的重要因素。本文旨在初步探讨miR-181b在Rb发生中的分子调控机制研究方法:在Rb细胞系HOX-RB44、Y79中检测NLK和miR-181b表达情况。通过转染干扰、过表达慢病毒探究miR-181b对视网膜母细胞瘤增值的影响。生物信息学预测miR-181b在NLK m RNA上调控位点。通过荧光素酶报告实验验证其与NLK m RNA3’UTR结合发挥负性调控作用。通过Real-Time PCR和western blot验证miR-181b对NLK以及NLK对下游Wnt/β-catenin信号的调控作用。研究结果:miR-181b在HOX-RB44、Y79中显著高表达,干扰miR-181b能显著抑制肿瘤细胞的增值而过表达miR-181b能显著促进肿瘤细胞的增值。NLK是miR-181b的直接靶点。NLK高表达能抑制Wnt/β-catenin信号通路下游基因β-catenin、cyclin D1、c-myc表达。研究结论:在视网膜母细胞瘤中miR-181b通过直接靶向抑制NLK发挥对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用从而影响肿瘤细胞的生长。