重型肝炎的治疗是临床上一大难题，常规内科治疗疗效欠佳，肝移植是肝衰竭的一种有效的治疗手段，但面临着患者病情危重及供体来源困难等情况。人工肝的研究为重型肝炎的治疗提供了一条崭新的途径。近年来随着肝细胞分离，高密度培养以及生物反应器等技术的日趋成熟，新一代以培养肝细胞为基础的结合了非生物人工肝与生物人工肝优点的混合型人工肝装置已成为研究热点。该方法在理论上解决了肝衰竭患者体内积累的大量代谢产物及毒性物质难以在有限的交换中由培养肝细胞解毒的问题，可使人工肝的生物合成转化功能及解毒作用更加完善。本研究旨在建立猪肝细胞高质量分离和培养的方法，并对培养肝细胞的功能和形态进行研究；使用重型肝炎血浆模型进行生物人工肝的体外实验，为临床应用提供理论基础；结合血浆置换与生物人工肝装置，构建一种新型稳定安全的混合型人工肝支持系统，并应用于临床，验证其有效性及安全性；对混合型人工肝系统可能引起的PERV传播的生物安全性问题进行探讨。 1．猪肝细胞的高质量分离和培养 采用改良两步胶原酶灌注法分离猪肝细胞，接种至培养瓶中培养l～7d，动态观察肝细胞活率、葡萄糖合成功能、安定转化功能、上清中白蛋白、LDH浓度，倒置相差显微镜、电镜观察培养肝细胞结构。结果显示肝细胞总数达1．510．4八‘中整肝，经台盼兰染色活率达9215％。肝细胞活率随培养时间的延长逐渐下降。经id－7d培养后上清液中ALT、AST、LDH的含量随培养时间的延长显著下降（P（．01）；而Alb和 GIOB的合成随着培养时间的延长逐渐上升。肝细胞培养上清中合成的葡萄糖浓度在 1～sh内逐渐上升，以培养 id的肝细胞合成葡萄糖能力最强，3d、sd、7d葡萄糖合成能力达到一个稳定水平。培养肝细胞在3d安定转化功能最强，此后随时间延长而降低。电镜观察培养1天后肝细胞间 2 2003浙江大学博士学位论文形成紧密连接和极性。本研究表明，新鲜分离的肝细胞在经2～3天的培养后无论在形态学还是功能学均处于最佳状态。为此我们建议在临床应用分离肝细胞作治疗时，最好选择经培养2～3天后的肝细胞，以便发挥其最大功能。 二．使用重型肝炎血浆模型进行生物人工肝的体外实验 收集重型肝炎血浆置换术患者的被置换血浆，作为生物人工肝治疗的血浆模型。将获得的总量约 5 XIO’活率在 90％以上的猪肝细胞置于 TECA工型中空纤维管式生物反应器中预培养4～6h，肝细胞循环流经中空纤维管的外管腔。生物反应器膜为混合纤维素纤维，孔径 200urn，分于截留量为 100kD。将收集到的重型肝炎患者血浆2000ml通过国产蠕动泵的驱动循环流经中空纤维管的内管腔进行体外循环共3h。生物人工肝对体外重型肝炎患者血浆进行3小时的循环处理后，总胆红素有明显下降o＜0刀5） 其余指标未见统计学意义，此外，血浆中钾、钠、氯、钙等电解质水平亦无明显变化。实验前肝细胞活率平均为 92．3士 2．4％，实验后肝细胞活率明显下降，变为刀．6士 10．3％，这与重型肝炎血浆中含有大量毒素经半透膜对猪肝细胞产生损害有关，也证明了混合型人工肝先置换去毒再行生物人工肝治疗的设计方法的正确性。应用重型肝炎患者的被置换血浆作为重型肝炎模型研究生物人工肝对重型肝炎的疗效，简便易行，值得推广应用。 3．混合型人工肝支持系统的构建及临床应用 我们在前述猪肝细胞分离及培养的实验基础上，结合血浆置换和生物人工肝，选择中国实验用小型猪为肝细胞供体，构建了一种新型的混合型人工肝支持系统，治疗15例重型病毒性肝炎患者。每次治疗后患者临床症状不同程度减轻，乏力、腹胀明显改善，腹水减少。总胆红素在HALSS治疗后有明显下降，PTa上升，缅氨酸有明显升高。与非生物型人工肝治疗组比较治疗后3天的生化指标 3 2003沁［江人学博士学位论义改变，发现总胆红素、直接胆红素、凝血酶原活动度、内毒素较单纯血浆置换组下降明显o＜0刀5卜 治愈好转率明显升高。15例患者中10例经混合型人工肝支持系统治疗肝细胞迅速坏死得到控制，在度过肝功能衰竭难关后接受进一步常规内科治疗，最终均好转出院；1例患者经过混合型人工肝支持治疗后成功地等到了供肝，进行了肝移植并存活至今；4例患者病情未好转死亡。所有患者在治疗中及治疗后12小时内未出现严重不良反应，除1例患者在治疗中出现轻微过敏反应，经对症处理后得到纠正，并继续接受混合人工肝支持治疗。我们构建的混合性人工肝支持系统对于慢性重型肝炎是一种安全有效的辅助支持和治疗手段，值得进一步扩大病例数进行深入临床应用研究。 4．HBLSS治疗中猪内源性逆转录病毒0