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[目 的]钩虫病在世界范围内普遍存在,尤其是在热带及亚热带地区的发展中国家,钩虫感染率较高,是这些地区乃至全球重要的公共卫生问题。在我国,钩虫感染居土源性线虫感染的首位,是危害我国国民健康的五大寄生虫之一。当前,钩虫感染的检测主要还是采用世界卫生组织推荐的改良加藤厚涂片法,该法经济方便,镜下观察到虫卵即可确诊;其他检测方法还有聚合酶链式反应、免疫学等。但是,这些方法都存在不同程度缺陷,如耗时长、灵敏度不高、操作复杂、需要昂贵的仪器设备、对操作人员要求高,容易造成漏检或误诊,使其难以在经济落后的地区推广应用。本研究旨在构建一种新型、快速、可视化的检测方法。[方 法]本研究根据美洲钩虫的ITS基因设计引物,采用环介导等温扩增技术(LAMP)对虫卵DNA进行扩增,并构建质粒作为标准阳性对照。本研究建立的扩增体系包括以下部分:10×Reaction Buffer、Primr Mix、dNTPs、ddH20、Bst DNA聚合酶、质粒模板、甲酚红(染料)、甜菜碱。经优化后的标准反应体系如下,总反应体系为 25μl:10×Reaction Buffer(100 mM(NH4)2SO4、500mM KCl、80 mM MgSO4、1%Tween 20,不加 Tris-HCl,调 PH 值 8.8)、1.6μM FIP/BIP、0.2μM F3/B3、0.4μM LF/LB、1.2mM dNTPs、0.8M 甜菜碱、50μM 甲酚红、8U Bst聚合酶、1μlDNA模板、ddH20,反应时间及温度分别为50min、65℃。本研究中采用甲酚红作为颜色指示剂,反应前为紫红色,发生阳性扩增后为亮黄色,阴性扩增则保持紫红色不变;设置PCR作为LAMP灵敏度平行对照实验。[结 果](1)构建了人体钩虫阳性质粒:a.克隆载体为PMD-18T,克隆片段大小是250bp,质粒浓度为83.315ng/μl,计算得拷贝数为3×1011copies/μl。b.委托合成的阳性质粒:克隆载体为pUC57,克隆片段大小是600bp,原始浓度为100ng/μl,计算得质粒拷贝数为3 × 1010 copies/μl。(2)LAMP扩增检出限为3X102copies/μl,平行对照实验PCR检出限为3×104 copies/μl,LAMP法的灵敏度是PCR法的100倍。(3)现场样本验证:敏感性为73.68%(14/19)。(4)对粪样DNA提取方法进行改进,提高PCR检出效果(15份人体钩虫卵阳性样本均成功扩增),具有较好的应用价值。[结 论]建立LAMP检测人体钩虫的实验体系:筛选出适宜的引物,优化反应体系,构建了可视化的快速(50min内可得出结果)检测方法。