【摘 要】
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手性醇是工业合成过程中的重要中间体,在许多药品、农药、天然产物的合成领域都具有非常广泛的应用。随着酶工程技术的进步,采用酮还原酶不对称还原潜手性酮进行手性醇的合成逐步成为人们研究的热点。（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇和（R）-3-氯-苯丙醇均是具有高附加值的手性醇。（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇是常用于合成唑类抗真菌药的重要中间体,（R）-3-氯-苯丙醇则是常用来合成西汀类抗抑
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手性醇是工业合成过程中的重要中间体,在许多药品、农药、天然产物的合成领域都具有非常广泛的应用。随着酶工程技术的进步,采用酮还原酶不对称还原潜手性酮进行手性醇的合成逐步成为人们研究的热点。（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇和（R）-3-氯-苯丙醇均是具有高附加值的手性醇。（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇是常用于合成唑类抗真菌药的重要中间体,（R）-3-氯-苯丙醇则是常用来合成西汀类抗抑郁症药物的药物中间体。本课题将从酶库中筛选到的酮还原酶用于（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇和（R）-3-氯-苯丙醇的合成。主要研究内容如下:1、酮还原酶的筛选。以2-氯-（2,4-二氯苯基）-乙酮作为筛选底物,用酮还原酶粗酶液进行筛选,有9种酮还原酶能够将20 mM底物完全转化为产物,其中来源于Lactobacillus kefri的酮还原酶LkCR83催化2-氯-（2,4-二氯苯基）-乙酮所产生的（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇的ee值达到了 99.6%,产率达到了 100%。以3-氯-苯丙酮作为筛选底物,有4种酮还原酶能够产生催化作用,其中CwCR39不对称催化3-氯-苯丙酮产生的（R）-3-氯-苯丙醇的ee值达到了 99.1%,其产率为32%。因而,选用这两种酶对它们的催化性能做进一步研究。2、LkCR83催化反应体系的优化及放大。研究温度、pH、菌体浓度、异丙醇浓度、辅酶浓度对LkCR83催化2-氯-（2,4-二氯苯基）-乙酮效率的影响。结果显示:在30℃、pH 7.0磷酸盐缓冲液中,当菌体浓度和底物浓度均为100 g/L、异丙醇浓度20%（v/v）、NADP+的浓度为0.5 mM时,LkCR83催化底物的产率在12 h达到了 99%以上。将优化反应体系放大至1 L,反应开始12 h后底物完全转化,对产物进行回收后获得产物91.8 g。经计算该反应中（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇的时空产率达到了 200 g/1/D,高于文献中报道的酶法合成（S）-2-氯-（2,4-二氯苯基）乙醇的时空产率,表明该方法具有很大的应用优势。3、CwCR39酶学性质表征。该酶的最适温度为35℃,最适pH为7.0。检测该酶在30℃条件下半衰期为96 h,在pH 7.0磷酸盐缓冲液中,该酶在24 h后相对酶活仍然能够保持在92%。Mn2+对该酶有激活作用,在4 mMMn2+的环境中,酶活增大2.68倍。这些结果表明在含4 mM Mn2+的pH 7.0缓冲液中进行酶催化将会更有利于（R）-3-氯-苯丙醇的合成。4、（R）-3-氯-苯丙醇的合成。3-氯-苯丙酮在水相中不稳定,将50 mM底物溶解于水中,1h后其水解量达到了 85%,所以采用双相法进行（R）-3-氯-苯丙醇的合成。分别采用甲基叔丁基醚、辛酸乙酯、正己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、正庚烷、正戊烷作为有机相与缓冲液按照2:8、3:7、4:6、5:5的比例构建双相系统,在底物浓度为10 mM条件下,反应2h后对反应结果进行分析,结果显示最优双相条件为:正戊烷与缓冲液的比例等于3:7（v/v）。利用纯酶在双相系统中进行底物浓度优化,3-氯-苯丙酮浓度为50 mM时为最优底物浓度。在该底物浓度条件下,构建2 mL全细胞催化体系,并对全细胞催化体系中CwCR39浓度、非离子表面活性剂种类及浓度、辅酶浓度进行优化,优化结果为:正戊烷30%（v/v）、CwCR39菌体1.25U/mL、1%（v/v）非离子表面活性剂Triton X-100、4 mM Mn2+、0.2 mM NAD+为最优化反应条件。在该条件下的2 mL反应体系中,产率在5 h内达到了 98.3%。改用20 mL反应体系进行反应,产率在反应5 h时达到97.2%,将反应时间延长至10 h产率为98.2%;将20 mL反应体系中的底物浓度降低至45 mM,产率在反应4 h后达到了 99.5%。将20 mL反应体系中的反应结果与文献中已经报道的（R/S）-3-氯-苯丙醇的生物法合成结果进行比较,结果表明:该合成方法底物浓度更高,更适用于氟西汀药物中间体的合成。
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