【摘 要】
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细胞是生物大分子在不同尺度下的超分子自组装体,它的高效催化活性来源于蛋白质的精确组织及其多尺度下独特的理化效应。随着合成生物学和纳米技术的发展,模拟胞内的多酶自组装体,构建体外多酶催化体系,研究纳米效应对多酶催化的影响规律,探索超分子催化在生物合成、临床诊断、传感检测等领域的应用,具有重要的科学意义和应用价值。本课题选取噬菌体P22蛋白笼状颗粒作为组装载体,通过单酶、多酶、支架蛋白、壳蛋白等组装模
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细胞是生物大分子在不同尺度下的超分子自组装体,它的高效催化活性来源于蛋白质的精确组织及其多尺度下独特的理化效应。随着合成生物学和纳米技术的发展,模拟胞内的多酶自组装体,构建体外多酶催化体系,研究纳米效应对多酶催化的影响规律,探索超分子催化在生物合成、临床诊断、传感检测等领域的应用,具有重要的科学意义和应用价值。本课题选取噬菌体P22蛋白笼状颗粒作为组装载体,通过单酶、多酶、支架蛋白、壳蛋白等组装模块的设计,构建获得具有辅因子NADPH自循环功能的“自给自足”的多酶超分子自组装体,初步探索了它的催化规律及在手性醇合成中的应用。本课题首先构建来源于Scheffersomyces stipitis羰基还原酶SsCR的单酶组装体P22-SsCR。经过对组装体的纯化和酶学性能表征,发现最适反应pH为6.0,最适反应温度为25℃,在pH 5.0-6.5之间组装体系的残余活力可以保持80%以上,pH 7.0孵育2h之后的残余活力仍保留80%,表现出较好的pH稳定性。相比于游离酶,组装体P22-SsCR对苯甲酰甲酸甲酯的底物抑制作用得到缓解,抑制常数Ki从1.6 mM提高到3.6 mM,催化效率kcat/KM提高了 4倍,达到182±9 mM-1 s-1。在单酶组装体构建基础上,本课题成功构建包含来源于Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶BmGDH的多酶组装体P22-BmGDH-SsCR,还原和氧化活力分别为12.81±0.69 U/mg和1.56±0.18 U/mg。通过考察蛋白笼中两种酶分子的表观动力学参数,我们发现还原酶对目标底物苯甲酰甲酸甲酯的kcat/Km高达575±45 mM-1 s-1,相比游离体系提高了 12.4倍,并通过氧化还原级联反应,验证了多酶组装体P22-BmGDH-SsCR内部辅酶NADPH的自循环。对比研究发现,多酶组装体P22-BmGDH-SsCR催化不对称合成扁桃酸甲酯的反应,12 h之内底物转化率达到99%;单酶组装体P22-SsCR在外加等活力GDH纯酶下8 h催化底物完全转化,而SsCR-SP催化反应24 h时仍未完全转化。考察辅酶NADPH浓度对催化反应的影响,发现催化体系中仅有10 μM NADP+的情况下,P22-BmGDH-SsCR仍能在12 h以内催化底物的完全转化,而SsCR-SP和游离BmGDH在24 h以内只有低于80%的转化率。表明两种酶在限域空间中的邻近效应有利于辅因子的高效循环利用。本课题成功构建了多酶自组装体,实现了辅酶NADPH自循环和双酶级联超分子催化氧化还原反应,完成一系列手性醇的合成。这一研究将为探究限域空间内的多酶协同催化反应提供理论基础。
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