【摘 要】
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猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人畜共患病原菌,严重威胁人类健康和养猪业健康发展。猪链球菌感染引起脑膜炎、关节炎、心内膜炎和肺炎等临床症状,甚至人和动物的死亡。猪链球菌有29种血清型,其中血清2型（SS2）流行范围最广、致病性最强。1998年和2005年猪链球菌2型在我国发生两次大规模爆发,2005年病人感染后首次表现出链球菌中毒性休克综合征。补体系统作为
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猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人畜共患病原菌,严重威胁人类健康和养猪业健康发展。猪链球菌感染引起脑膜炎、关节炎、心内膜炎和肺炎等临床症状,甚至人和动物的死亡。猪链球菌有29种血清型,其中血清2型（SS2）流行范围最广、致病性最强。1998年和2005年猪链球菌2型在我国发生两次大规模爆发,2005年病人感染后首次表现出链球菌中毒性休克综合征。补体系统作为天然免疫和获得性免疫的中间环节,是免疫系统的重要组成部分,在微生物侵入后迅速被激活。补体系统由30种补体蛋白和调节因子组成,补体系统的激活可以通过调理吞噬作用清除病原微生物,在革兰氏阴性菌中还可以通过攻膜复合体的形成直接杀伤病原微生物。病原微生物也进化出一系列逃逸补体系统攻击的策略,从而在宿主体内生长繁殖,因此筛选补体结合蛋白并鉴定其对补体系统的影响具有重要的意义。本实验室前期在猪链球2型SC-19菌株全基因组文库中筛选出多种不同补体组分的结合蛋白。本论文从ApuA与补体C3b的相互作用、对补体系统的影响及其对猪链球菌致病性和抗吞噬作用的影响进行了研究,主要研究成果如下:（1）ApuA与C3b相互作用介导猪链球菌的补体逃逸本研究用大肠杆菌表达系统纯化了重组蛋白His＿ApuA和His＿C3b,用ELISA和Far-Western blot实验证实了ApuA与C3b可以相互作用。为了研究ApuA是否影响补体系统的功能,我们进行了补体介导的溶血实验,发现与重组ApuA（r ApuA）孵育后的正常人血清对与溶血素结合的绵羊血的溶血活性降低,结果表明ApuA对补体经典激活途径有抑制作用。但是在DGHB-Mg-EGTA缓冲液条件下,与r ApuA孵育后的正常人血清对兔血的溶血活性没有变化,说明ApuA不影响补体旁路途经的激活。同时我们进行了补体激活实验,发现经典途径和旁路途经激活实验中,C3的沉积量随着r ApuA浓度的增加而增多,但是凝集素途径激活实验中,C3沉积量与r ApuA浓度不相关,说明ApuA可以直接激活经典途径和旁路途经,但不能激活凝集素途径。为更直接的观察ApuA在猪链球菌逃逸补体免疫中发挥的作用,我们以SS2强毒株SC-19为出发菌株构建了apu A的缺失突变株（Δapu A）及其互补菌株（CΔapu A）。然后进行了C3沉积实验,发现Δapu A表面的C3沉积量小于SC-19,说明ApuA可以抑制C3在猪链球菌表面的沉积。为了观察ApuA对猪链球菌的抗吞噬能力的影响,我们进行了血清杀伤实验和全血杀伤实验,结果发现Δapu A在血清和全血中的存活率低于SC-19和CΔapu A,由此可知ApuA可以增强猪链球菌在血清和全血中的生存能力。同时,我们进行了吞噬实验,发现RAW264.7对Δapu A的吞噬率高于SC-19和CΔapu A,表明ApuA可以阻碍RAW264.7对猪链球菌的吞噬。调理吞噬实验的结果显示与PMNs和正常人血清一起孵育后,Δapu A的存活率低于SC-19和CΔapu A,表明ApuA可以抑制PMNs对猪链球菌调理吞噬作用。为了探究ApuA对猪链球菌致病性的影响,进行了小鼠感染实验,结果发现腹腔注射Δapu A小鼠的死亡率低于注射SC-19的小鼠。表明ApuA可以提高猪链球菌对小鼠的致病性。（2）ApuA缺失影响猪链球菌的生长速率和链长为了探究ApuA对猪链球菌本身表型的影响,我们对SC-19、Δapu A和CΔapu A菌株分别进行了生长曲线的测定和对数期生长速率的计算,发现Δapu A在生长对数期的生长速率大于SC-19和CΔapu A,表明ApuA能促进猪链球菌的生长速率。进行革兰氏染色后用光学显微镜可以观察到Δapu A的链长长于SC-19和CΔapu A。用软件计算链长,发现Δapu A的平均链长明显长于SC-19和CΔapu A。表明ApuA影响猪链球菌的链长。为了观察ApuA对细菌形态是否有影响,我们进行了扫描电镜观察,发现SC-19、Δapu A和CΔapu A的细菌形态没有明显差异,但是SC-19和CΔapu A主要以1-4个细胞的链存在,但大部分Δapu A的链多于4个细胞。表明ApuA不影响猪链球菌的形态,但是影响链长。
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