【摘 要】
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“疯草(locoweed)”主要是指豆科黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物。目前,疯草已成为危害草原畜牧业发展的主要毒草,且广泛分布于世界各地。据统计,在美国和中国,每年的经济损失高达2000万~1亿美元,严重阻碍畜牧业的可持续发展。众所周知,疯草的主要毒性成分—苦马豆素(SW)是一种吲哚里西啶类生物碱,其结构与甘露糖高度相似,并且与甘露糖苷酶有极高亲和力,从而竞
【基金项目】
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国家自然科学基金(编号:31201958); 陕西省自然科学基金重点项目(编号:2017JZ004); 国家“十二五”公益性行业(农业) 科研专项(编号:201203062);
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“疯草(locoweed)”主要是指豆科黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物。目前,疯草已成为危害草原畜牧业发展的主要毒草,且广泛分布于世界各地。据统计,在美国和中国,每年的经济损失高达2000万~1亿美元,严重阻碍畜牧业的可持续发展。众所周知,疯草的主要毒性成分—苦马豆素(SW)是一种吲哚里西啶类生物碱,其结构与甘露糖高度相似,并且与甘露糖苷酶有极高亲和力,从而竞争性抑制II类α-甘露糖苷酶活性,导致糖代谢紊乱。动物采食后引起的中毒病主要以神经机能紊乱为特征,严重者可导致死亡,病理变化主要表现为广泛的组织细胞空泡变性。自噬是指在外界环境因素影响下,细胞将自身受损、变性、衰老的大分子物质或细胞器,以及侵入体内的病原体运送到溶酶体进行自我消化的生物学过程。有资料显示,当自噬过程发生障碍时往往伴随着空泡样病变。鉴于此,本研究以小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)为试验模型,探讨SW对TCMK-1细胞中自噬相关蛋白表达的影响,阐明自噬在SW致TCMK-1细胞损伤中的调控作用,为进一步阐明疯草中毒机制提供理论依据。试验结果如下:1.苦马豆素诱导TCMK-1细胞发生自噬Western blot检测自噬标志物LC3蛋白表达。用800μg/m L的SW处理不同时间,LC3-II/β-actin比率以时间依赖性方式增加,在12 h表达量最高,且各时间点与对照组之间差异均有统计学意义。随后用不同浓度的SW(0、200、400、800μg/m L)处理细胞12 h,LC3-II/β-actin比率也以剂量依赖性方式增加,且组间差异均有统计学意义。同时,随着剂量的升高,自噬相关蛋白Beclin1表达量也显著升高。DAPI、MDC和LC3-II免疫荧光染色。用不同浓度的SW(0、200、400、800μg/m L)处理细胞12 h,对照组细胞MDC染色呈弥漫性,而处理组细胞出现荧光聚点,表明广泛的MDC阳性自噬泡;LC3-II荧光染色结果显示,SW增加了LC3-II斑点在TCMK-1细胞中的形成,且荧光强度随剂量升高而增强,而对照组不明显。另外,通过透射电镜检测细胞的超微结构,在800μg/m L SW处理的细胞中,可以观察到自噬泡数量明显增多。上述结果表明,SW可诱导大量的自噬泡产生。此外,由于上游自噬体形成增加或下游自噬体降解受阻,LC3-II均可以增加。因此,为了区分这两种可能性,我们使用了自噬抑制剂—氯喹(CQ)。用400μg/m L SW或20μM CQ单独处理以及SW与CQ联合处理细胞,SW与CQ均可以使LC3-II表达显著上升,且联合处理后LC3-II表达呈累加效应,说明SW诱导了自噬。2.苦马豆素导致自噬降解途径受阻p62是连接LC3-II与待降解泛素化底物的桥梁,试验发现p62蛋白表达水平并没有降低,而是随着剂量和时间的增加而增加。另外,RT-PCR试验结果显示LC3-II基因的表达量随剂量的增加显著上升,而p62基因的表达量无变化。p62的积累表明自噬的最终降解可能受阻。自噬降解受阻可能是溶酶体的功能受损,也可能是自噬体与溶酶体融合发生障碍。因此,试验通过激光共聚焦检测LC3-II与溶酶体膜蛋白LAMP-2的共定位来判断自噬体与溶酶体的融合是否受阻。结果显示,对照组无明显的LC3-II及LAMP-2荧光反应,饥饿处理组有明显的LC3-II及LAMP-2荧光反应,且共定位显著,SW处理组也有明显的共定位。但是,通过透射电镜观察空泡样病变时发现,在空泡周围有大量溶酶体聚集,同时还存在少量自噬体,说明可能是溶酶体降解功能受损导致自噬降解受阻。3.PI3K/Akt/m TOR信号通路参与调节苦马豆素诱导的自噬采用Western blot检测自噬信号通路PI3K/Akt/m TOR相关蛋白的表达。用不同浓度SW处理TCMK-1细胞,随着SW浓度的增加,p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达水平显著下降,而总的PI3K、Akt、m TOR保持不变。此外,试验还对m TOR下游p70S6K、4EBP1的激活状态进行了检测,p-p70S6K、p-4EBP1蛋白表达量也显著降低,而总的p70S6K、4EBP1保持不变。以上研究结果表明,自噬信号通路PI3K/Akt/m TOR参与SW诱导的TCMK-1细胞自噬。上述结果表明,苦马豆素可以诱导TCMK-1细胞发生自噬,同时引起自噬降解阶段发生障碍,但不影响自噬体与溶酶体的融合,说明自噬降解障碍可能与溶酶体功能受损有关。此外,PI3K/Akt/m TOR信号通路参与调控苦马豆素诱导的细胞自噬。该项研究为深入探讨苦马豆素毒性作用机制提供一定的理论依据。
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