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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是全球第二大常见的中枢神经系统退行性疾病,其典型的病理特征为黑质致密部（Substantia nigra pars compacta,SNpc）多巴胺能神经元的渐进性缺失,导致释放到纹状体（Striatum,Str）的多巴胺（Dopamine,DA）减少,最终引起运动功能障碍。内源性大麻素（Endocannabinoids,e CBs）主要包括N-花生四烯酰乙醇胺（N-arachidonoylethanolamine,AEA）和2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoylglycerol,2-AG）。e CBs系统中的大麻素受体主要有两种:大麻素受体1（Cannabinoid receptor 1,CB1R）和大麻素受体2（Cannabinoid receptor2,CB2R）。其中CB1R主要位于突触前膜,可被突触后神经元释放的e CBs激活,产生突触前抑制作用。CB1R在脑内高表达于基底神经节、海马、小脑和大脑皮层,参与记忆,认知和运动控制的调节。近年有研究表明PD动物模型基底神经节中e CBs系统活性增强,包括CB1R m RNA表达增加、CB1R活性增强、表达增加,AEA水平升高以及e CBs清除率下降等。因此,CB1R拮抗剂可能在PD的治疗中发挥重要的调控作用。NESS 0327是一种新型的CB1R拮抗剂,对CB1R具有极强的亲和力。但其在PD模型中的作用及可能的机制尚不清楚。因此,本实验选用经典的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的C57BL/6J小鼠亚急性PD模型,通过免疫印迹（Western Blot）、免疫荧光及行为学等实验技术探究NESS 0327对MPTP诱导的亚急性PD小鼠模型的保护作用以及参与的脑区,并探讨其可能的机制。方法:1.利用旷场实验、爬杆实验、步态分析实验等行为学测试方法研究小鼠的运动功能。2.利用免疫荧光技术观察小鼠黑质区TH阳性细胞数目的变化。3.利用Western blot技术检测小鼠黑质区TH蛋白的表达变化。结果:1.应用MPTP制备PD亚急性小鼠模型,并同时腹腔注射（Intraperitoneal injection,i.p.）CB1R拮抗剂NESS 0327,采用爬杆实验观察NESS 0327对MPTP诱导的PD模型小鼠爬杆能力的影响。爬杆实验结果表明,MPTP处理后,小鼠的转头时间和下杆时间与对照组小鼠相比均有所延长（P＜0.001）,而同时连续5天给予NESS 0327（Multiple,i.p.）能够有效拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠转头时间（P＜0.05）及下杆时间的延长（P＜0.05）,差别具有统计学意义;而在行为学实验前30 min一次性给予NESS 0327（Single,i.p.）并不影响MPTP处理组小鼠的转头时间和下杆时间。2.应用旷场实验检测小鼠的运动距离及运动速度的变化。结果表明MPTP处理可导致小鼠的移动距离减少（P＜0.05）和移动速度下降（P＜0.05）,同时连续5天给予NESS 0327（Multiple,i.p.）可以改善MPTP诱导的PD模型小鼠移动距离的减少（P＜0.01）和移动速度的下降（P＜0.01）,差别具有统计学意义;而在行为学实验前30min给予NESS 0327（Single,i.p.）,小鼠的移动距离和移动速度与MPTP组相比,差异无统计学意义。3.应用Western blot技术检测小鼠SN区的酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）蛋白的表达变化。结果表明与对照组相比,MPTP组小鼠SN区TH的蛋白表达明显降低（P＜0.05）,同时连续5天给予NESS 0327（Multiple,i.p.）可以拮抗MPTP诱导的TH蛋白水平的降低（P＜0.05）,差别具有统计学意义;而在行为学实验前30min给予NESS 0327（Single,i.p.）并不能抑制MPTP诱导的TH蛋白水平的降低。4.应用免疫荧光技术检测小鼠SN区TH阳性细胞数目的变化。结果表明与对照组相比,MPTP组小鼠SN区的TH阳性细胞数目明显减少（P＜0.05）,同时连续5天给予NESS 0327（Multiple,i.p.）可以拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠SN区TH阳性细胞数目的减少（P＜0.05）,差别具有统计学意义;而在行为学实验前30min给予NESS 0327（Single,i.p.）并不能抑制MPTP诱导的PD模型小鼠SN区TH阳性细胞数目的减少。因此,我们选用连续5天给予NESS 0327进行后续实验。5.应用步态分析实验检测小鼠的步态变化情况。实验结果表明与对照组相比,MPTP组小鼠出现明显的步态不稳以及肢体不协调等症状。具体表现为:小鼠通过20cm的轨道时间延长（P＜0.01）、移动速度下降（P＜0.01）、右前肢站立时间延长（P＜0.01）、支撑时相比增加（P＜0.001）、前后爪同时触地时间延长（P＜0.01）、前爪的移动速度下降（P＜0.001）、左前爪最大强度时间相对于持续时间的比值增大（P＜0.05）、左前爪摆动速度下降（P＜0.05）、左前爪的步周长减小（P＜0.05）差别具有统计学意义,而在给予MPTP的同时连续5天给予NESS 0327（i.p.）可以拮抗MPTP诱导的小鼠通过20cm的轨道时间延长（P＜0.05）、移动速度下降（P＜0.05）、右前肢站立时间延长（P＜0.01）、支撑时相比增加（P＜0.001）、前后爪同时触地时间延长（P＜0.01）、前爪的移动速度下降（P＜0.05,P＜0.01）、左前爪最大强度时间相对于持续时间的比值增大（P＜0.05）、左前爪摆动速度下降（P＜0.05）、左前爪的步周长减小（P＜0.05）,差别具有统计学意义。6.应用立体定位技术在纹状体埋置套管,通过套管给予NESS 0327后观察其对MPTP诱导PD模型小鼠的运动功能的影响。爬杆实验结果表明纹状体给予NESS0327可以有效拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠转头时间的延长（P＜0.001）,同时也可以有效拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠下杆时间的延长（P＜0.05）,差别具有统计学意义。旷场实验结果表明通过套管在纹状体给予NESS 0327可以拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠移动距离的减少（P＜0.05）,同时也可以有效拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠的速度下降（P＜0.05）,差别具有统计学意义。7.应用Western blots技术检测小鼠SN区TH蛋白的表达变化。实验结果表明,与对照组相比,MPTP组小鼠SN中TH蛋白的表达量明显减少（P＜0.05）,差异有统计学意义;而在纹状体给予NESS 0327并不能逆转MPTP诱导的PD模型小鼠SN区TH蛋白表达的降低。免疫荧光实验结果表明,MPTP组小鼠SN中TH阳性细胞数目明显减少（P＜0.001）,差异有统计学意义;而在纹状体给予NESS0327并不能逆转MPTP诱导的PD模型小鼠SN区TH阳性细胞数目的减少。8.进一步的实验结果表明腹腔注射AMPA受体阻断剂DNQX可以阻断NESS 0327（Str）对MPTP诱导的PD模型小鼠的运动障碍改善作用。在爬杆实验中,NESS0327（Str）可以抑制MPTP诱导的PD模型小鼠转头时间的延长（P＜0.001）,差异具有统计学意义;在旷场实验中,NESS 0327（Str）可以抑制MPTP诱导的PD模型小鼠的移动距离减少（P＜0.05）和移动速度降低（P＜0.05）;上述行为学改变可被AMPA受体阻断剂DNQX（i.p.）阻断（P＜0.001,P＜0.05）,而GABA受体阻断剂Bicuculline（i.p.）并不能阻断NESS 0327（Str）对MPTP诱导的PD模型小鼠的保护作用。9.实验结果表明在纹状体给予NESS 0327并不能逆转MPTP诱导的PD模型小鼠SN区TH阳性细胞数减少。GABA受体阻断剂Bicuculline或AMPA受体阻断剂DNQX处理也不影响MPTP/NESS 0327（Str）组小鼠造成的SN区TH阳性细胞数目。结论:综上所述,本实验探究了CB1R拮抗剂NESS 0327对MPTP诱导的PD模型小鼠的运动功能障碍的调节作用及其可能的机制。实验结果表明,NESS 0327能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠的运动功能障碍,并拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠SN区多巴胺能神经元的损伤;此外,纹状体给予NESS 0327能够拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠的运动功能障碍,提示纹状体可能是NESS 0327发挥运动功能调节的脑区之一;进一步的实验结果表明AMPA受体拮抗剂DNQX可以阻断NESS 0327（Str）对MPTP诱导的PD模型小鼠的运动障碍改善作用,而GABA受体拮抗剂Bicuculline并不能阻断NESS 0327（Str）对MPTP诱导的PD模型小鼠的保护作用。结果提示NESS 0327在纹状体发挥运动保护作用可能是通过调节谷氨酸的释放,影响AMPA受体而实现的。以上结果为调控内源性大麻素在缓解PD的运动障碍中提供了新的证据及防治靶点。