研究背景：缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R) 导致大鼠心肌收缩/舒张功能降低，同时胞内钙瞬变峰值减低、Ca2+清除延迟。心肌肌浆网钙-ATP酶(SERCA2a) 通过摄Ca2+进入肌浆网(SR)，调节心肌细胞内Ca2+；其表达及活性改变是引发胞内钙超载及心肌功能损伤的重要原因。 我们前期的研究显示，胰岛素可通过磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B(PI3kinase-Akt) 这一“生存信号”，促进I/R 心肌功能恢复，其中Akt 激活是胰岛素发挥作用的关键，但这一信号途径的下游机制未完全清楚。 有报道指出，人类晚期心衰患者的左心室细胞过表达SERCA2a 基因能有效恢复胞内钙循环；另有研究表明，大鼠心肌转基因过表达蛋白激酶B (Akt)可使心肌细胞内钙瞬变增强，心肌收缩/舒张功能也明显改善。但迄今为止，胰岛素诱导的I/R 心肌细胞Akt 信号激活，与细胞内SERCA2a 表达和活性变化存在何种关联；这是否是胰岛素改善I/R 心肌收缩功能的下游信号机制尚不清楚。 研究目的 1．观察胰岛素对大鼠I/R 心肌细胞内SERCA2a 表达及活性的影响。 2．观察胰岛素对I/R心肌细胞收缩功能和胞内Ca2+的影响，探讨其中SERCA2a的作用及其作用机制。 实验方法 1．酶解分离成年大鼠心肌细胞，分四组： (1) 对照组； (2) 缺血/再灌注组；(3) 缺血/再灌注胰岛素组(10-7 mol/L)；(4) 缺血/再灌注胰岛素+Akt特异性阻断剂(AI) 组。 2．将分离心肌细胞在化学缺氧液中孵育15 分钟后，恢复灌注30 分钟；制备缺血/再灌注模型。 3．采用可视化动缘探测系统检测各组单心肌细胞的收缩/舒张指标，以及胞内钙瞬变情况。 4．采用免疫蛋白印迹技术(Western-Blot) 检测各组心肌细胞Akt，磷酸化Akt (pAkt)，SERCA2a 以及SERCA2a 的天然抑制蛋白PLB 和磷酸化PLB的蛋白水平。 5．定磷法测定各组SERCA2a 的活性。 实验结果 1．胰岛素明显改善了I/R 心肌细胞的收缩功能。 与对照组相比，再灌注时给予胰岛素，不但增强了细胞的收缩幅度比率(PTA％baseline) (I/R+Ins组：20.7 ± 0.7 ％ vs. I/R组：14.5 ± 0.7 ％；P<0.05，n = 20)，还使细胞收缩达峰值时程(TPS) 以及舒张70 ％的时程(TR70) 缩短，细胞的最大收缩速率(+dL/dt) (I/R+Ins组：322 ± 12 μm·s-1 vs.I/R组：279 ± 29 μm·s-1；P<0.05，n = 20) 以及最大舒张速率(-dL/dt)(I/R+Ins组：302 ± 7 μm·s-1 vs. I/R组：241 ± 10 μm·s-1；P<0.05，n = 20) 都比较对照组显著增加。上述结果表明胰岛素可显著改善缺血/再灌注后的心肌细胞收缩功能。 2．胰岛素可使心肌细胞胞内钙瞬变明显增强。 同样，与对照组相比，胰岛素可增加缺血后细胞内钙瞬变幅度比率(ΔFFI) (I/R+Ins组：0.36 ± 0.04 vs. I/R组：0.32 ± 0.03；P<0.05，n = 20)。并且，胰岛素使细胞内钙达峰值时程(TTPCa) (I/R+Ins组：61.2 ± 2.0 ms vs. I/R组：77.5 ± 3.5 ms；P<0.01，n = 20) 以及舒张期Ca2+减少50 ％时程(T50DCa) (I/R+Ins组：206 ± 9 ms vs. I/R组：278 ± 8 ms；P<0.01，n = 20) 明显缩短。这些结果表明胰岛素能增强缺血/再灌注后心肌细胞内的钙瞬变。 3．胰岛素可使I/R 心肌细胞胞内磷酸化Akt 和pPLB 表达增强，同时使SERCA2a 的活性水平增高。 Akt 和PLB 蛋白表达在I/R 处理后无显著差异，但胰岛素使再灌注心肌细胞磷酸化Akt (pAkt) 的蛋白表达增加(I/R+Ins 组vs. I/R 组；P<0.01，n = 5)； SERCA2a 抑制蛋白，受磷蛋白磷酸化表达(pPLB) 也相对I/R组增加(P<0.01，n = 5)。 SERCA2a蛋白表达在胰岛素组与对照组无显著差异(P>0.05，n = 5)； 但实验显示，缺血/再灌注时SERCA2a 的活性显著降低；而再灌注早期给予胰岛素显著增强pPLB表达的同时，心肌细胞的SERCA2a活性也比I/R组明显增加(I/R+Ins组：7.8 ± 0.4 mol Pi·mg protein-1·h-1 vs. I/R组： 6.8 ± 0.6mmol Pi·mg protein-1·h-1；P<0.05，n = 8)。这些结果显示，胰岛素通过激活Akt信号对I/R心肌细胞发挥作用的同时，对细胞内PLB蛋白磷酸化及SERCA2a活性也产生影响。 4．胰岛素诱导的细胞正性变力作用、胞内钙瞬变增强、pAkt、pPLB 的蛋白表达增强以及SERCA2a 活性增加均可被Akt 特异性阻断剂(AI) 阻断。 在使用AI 后，胰岛素对I/R 细胞pAkt (I/R+Ins+AI 组vs. I/R+Ins 组，P<0.01，n = 5) 以及PLB 磷酸化表达(I/R+Ins+AI 组vs. I/R+Ins 组，P<0.05，n = 5) 增强效应显著降低；同时对SERCA2a 活性的增加作用也消失(I/R+Ins+AI 组vs. I/R+Ins 组，P<0.05，n = 8)。 与胰岛素组相比，使用AI 后，胰岛素增强I/R 细胞收缩功能的作用被取消(与I/R+Ins 组相比P<0.05， n = 20)；其增强细胞内钙瞬变的作用也被消除(与I/R+Ins 组相比P<0.01，n = 20)。 以上结果可提示，胰岛素通过激活Akt 信号，解除I/R 心肌细胞内PLB 蛋白对SERCA2a 活性的抑制，进而增强I/R 心肌细胞收缩功能以及胞内钙瞬变。 结论 1．再灌注时给予胰岛素，明显改善I/R 心肌细胞收缩功能及胞内钙瞬变水平。 2．再灌注时给予胰岛素明显增加了I/R心肌细胞内SERCA2a活性，使其作为PI3K-Akt信号通路的下游信号分子，通过对细胞内Ca2+的调节，参与了胰岛素增强I/R心肌细胞收缩功能以及胞内钙瞬变的作用。