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以纯化的G<,o>α和GAP-43为对象,研究了GAP-43对G<,o>α的激活及其构象变化基础;研究了在GAP-43存在下G<,o>α的寡聚化和GTPγS引起的解聚及其对GTPγS结合活力的影响,主要的研究结果如下:1.豆蔻酰化G<,o>α在大肠杆菌中的表达和纯化 在共转化了pQE60-G<,o>α和pBB131-NMT和E.coli JM109菌株中表达了豆蔻酰化的大鼠G<,o>α并通过Phenyl Sepharose和Q Sepharose层析得到了电泳纯的豆蔻酰化G<,o>α,与从组织中纯化的天然G<,o>α相同,表达的G<,o>α也能进行特异性的体外棕榈酰化,且棕榈酰化位点和体内相同.2.GAP-43的纯化 用去污剂抽提法和碱抽提法从牛脑皮层中纯化得到了GAP-43.EGS化学交联实验确证了该蛋白无钙时和钙调蛋白结合,有钙时同钙调蛋白解离.比较两种纯化方法表明,碱抽提法是一种更为经济、有效的方法.3.GAP-43显著促进G<,o>α的GTPγS结合活力 经Bio-beads吸附法去除纯化的GAP-43样品中所含的Lubrol PX后,GAP-43可促进重组豆蔻酰化G<,o>α的GTPγS结合活力,随GAP-43浓度增高,其促进作用增强.4.GAP-43激活G<,o>α的构象变化基础 用CAM-Sepharose亲和柱的实验结果表明GAP-43与G<,o>α·GDP之间存在直接的相互作用.这种相互作用所引起的G<,o>α的构象变化的测定结果显示,GAP-43使G<,o>α·GDP的色氨酸内源荧光发射谱谱峰蓝移4nm,其荧光强度增高35.3﹪,并使其HB的淬灭效率明显增加,其表观淬灭常数(Ksv)由1.1±0.22×10<5>增至4.1±0.43×10<5>(M<-1>).而对G<,o>α·GTPγS无明显影响,表明GAP-43直接作用于G<,o>α·GDP引起其构象变化,从而加速GDP的解离和GTP的结合,导致G<,o>α的激活并启动G蛋白的循环实现信号的跨膜转导和放大.我们的研究结果对阐明信号转导介导分子G蛋白在偶联受体和效应器之间的作用机理提供了有力的实验证据,对进一步深入揭示GDP和GTP的交换方式在G蛋白的循环中的关键作用提供了有力的实验证据.5.G<,o>α的寡聚化和GTPγS激活引起的解聚及其GAP-43的影响 经聚丙烯酰胺活性梯度凝胶电泳和分子筛层析分析表明,G<,o>α自身能形成寡聚体,且不受盐浓度的影响,GTPγS激活G<,o>α后使G<,o>α的寡聚体解聚成单体.运用化学交联剂p-PDM可使G<,o>α形成多种交联产物,且NEM修饰可有效抑制G<,o>α的p-PDM交联产物的形成,而GTPγS激活后的G<,o>α交联产物不明显,主要为单体.