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人参号称“百草之王”是我国的传统名贵药材，人参皂苷是人参中的主要活性成份。人参皂苷根据其皂苷元结构可分为达玛烷型（dammarene）和齐墩果烷型(oleanane)。其中绝大部分人参皂苷属于达玛烷型，即原人参二醇型（protopanaxadiol，PPD）和原人参三醇型（protopanaxatriol，PPT）。在原人参二醇型皂苷中，Compound K(CK)、Rh2和Rg3因在人参中含量极低（或者无法检测到）亦被称为稀有人参皂苷。这些稀有人参皂苷具有较好的生理功能，如提高免疫力、抗肿瘤、抗炎症等，有重要的应用前景。由于含量极低，稀有人参皂苷的制备需要通过化学或生物的方法对人参总皂苷进行糖基水解后再分离提纯。这些传统的制备方法依赖于人参皂苷资源的供给，而野生的人参资源已基本耗竭，且人参的人工栽培又面临生长周期长、病虫害和连作障碍等问题，人参皂苷资源的供给、品质及安全性都面临挑战。采用合成生物学方法，在微生物细胞中构建相应的细胞工厂，已经被证明是合成结构复杂的天然产物最具前景的策略。 在日本和韩国科学家解析PPD合成途径的基础上，本研究从人参中克隆并鉴定了人参皂苷合成相关3个UDP-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）以及2个NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450reductase，CPR)，构建与优化了合成PPD的酵母底盘细胞以及分别合成CK、Rh2和Rg3的细胞工厂。实现了从葡萄糖到稀有人参皂苷的从头合成，为这些皂苷的药理药效研究及其药用开发奠定了基础。具体完成的工作如下: 通过对人参属植物的转录组数据进行拼接和注释，从中获得了一批UGT候选基因。设计引物从人参cDNA样品中克隆了其中45个UGT基因（UGTPg1-45）。通过对这些UGT进行表达和筛选，获得了3个UGT:其中UGTPg1可以特异性催化PPD及PPD型人参皂苷的C20-OH的葡萄糖基化修饰，例如将PPD转化为CK;UGTPg45可以特异性催化PPD及PPD型人参皂苷的C3-OH的葡萄糖基化修饰，例如将PPD和CK分别转化为Rh2和F2;UGTPg29则特异在PPD型人参皂苷的C3位糖基上再延伸一个葡萄糖基，例如将Rh2和F2分别转化为Rg3和Rd。此外，基于植物CPR的保守结构域，通过对人参转录组数据进行BLAST搜索获得了2个CPR候选基因，PgCPR1和PgCPR2。通过体外微粒体催化实验表明这两个CPR均可与催化达玛烯二醇(Dammarenediol-Ⅱ，DM)合成PPD的P450CYP716A47协同作用，高效将DM转化为PPD。 为构建稀有人参皂苷的酵母细胞工厂，我们对产人参皂苷前体PPD的酿酒酵母底盘细胞进行了构建与优化。首先比较了常用的拟南芥来源的CPR元件(ATR2.1)与人参中新获得的2个CPR元件(PgCPR1和PgCPR2)对PPD产量的影响，确认了PgCPR1为PPD合成的最佳元件。随后采用合成生物学“设计-构建-测试”循环策略，先后进行了第一、第二代产PPD的酵母底盘细胞的构建。通过对限速步骤优化，增强前体基因表达构建了第一代PPD底盘菌株ZW-PPD-B，在摇瓶发酵下其PPD产量为75.3mg/L。在测试第一代菌株表型的基础上，我们设计和重构了第二代PPD底盘菌株。采用模块化的方式对前体途径进行整体优化和细胞色素P450的表达优化等策略构建了菌株ZWBY04-RS，其PPD产量比第一代菌株ZW-PPD-B提高了近7倍，达到595.7mg/L。 采用高拷贝质粒在酿酒酵母中将UGTPg1、PgDDS和PgPPDS共表达，我们构建了菌株AK1，首次实现了CK在酵母中的合成，产量为243.8μg/L。在该菌株中我们首次发现并鉴定了一个新化合物20S-O-β-(D-glucosyl)-dammarenediolⅡ(20-DMG)，随后发现该化合物可以被细胞色素P450CYP716A47转化为CK。结合体内与体外实验证实在酿酒酵母细胞中可能存在一条新的由DM到20-DMG再到CK的合成途径。基于优良的PPD酵母底盘细胞，我们对CK细胞工厂进行了重构与优化，使CK产量相比菌株AK1提升了640多倍，达到155.6mg/L。同样，我们在第一代和第二代PPD酿酒酵母底盘细胞分别导入UGTPg45或组合导入UGTPg45和UGTPg29实现了稀有人参皂苷Rh2和Rg3的从头合成，产量分别达到52.7mg/L和79.5mg/L。 本研究不仅首次解析了多种二醇型人参皂苷包括CK、Rh2、Rg3、F2和Rd的合成途径，实现了3种具有重要生理功能的稀有人参皂苷CK、Rh2和Rg3在酿酒酵母中的高效合成，还为采用合成生物学方法通过酵母发酵合成其他植物萜类化合物搭建了技术平台。