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目的:本研究探讨mi R-122对人脐带血间充质干细胞(h UCB-MSCs)增殖和诱导向肝细胞分化能力的影响,在此基础上进一步探究mi R-122修饰的人脐带血间充质干细胞对慢加急性肝衰竭大鼠肝脏组织病理生理学和细胞凋亡的影响。方法:1.人脐带血间充质干细胞的收集、培养及mi R-122转染:将收集的脐带血通过磁激活细胞分选的方法分离人脐带血间充质干细胞,利用流式细胞术检测间充质干细胞表面抗原(CD29、CD90、CD34及CD45)。将h UCB-MSCs分为三组,分别为无任何干预的空白组(Control),空质粒转染的对照组(NC-vector),高表达mi R-122的质粒转染组(mi R-122-vector)。在倒置显微镜下观察细胞形态,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测mi R-122的转染效率。2.细胞增殖检测:通过MTT法检测mi R-122转染后h UCB-MSCs的增殖活性,并通过免疫荧光染色观察mi R-122转染后增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。3.肝细胞定向分化能力检测:上述三组给或不给予诱导剂(Inducible factor)干预,并使用肝细胞定向分化培养基培养h UCB-MSCs细胞7d。使用q RT-PCR和蛋白质印迹实验(Western blot)检测肝细胞分化标志蛋白的表达,包括甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白18(CK-18)、细胞角蛋白19(CK-19)和细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)。4.肝损伤、慢加急性肝损伤模型构建及mi R-122-h UCB-MSCs移植后的疗效分析:使用人血清白蛋白(HSA)建立慢性肝损伤大鼠模型,再联合使用D-氨基半乳糖(D-gal)和脂多糖(LPS),构建慢加急性肝衰竭大鼠模型(ACLF),对照组给予生理盐水。将建立好的慢加急性肝衰竭大鼠模型随机分为3组:ACLF组,ACLF+NC-MSCs组,ACLF+mi R-122-MSCs组。三组通过尾静脉分别注射生理盐水、NC-h UCB-MSCs悬液、mi R-122-h UCB-MSCs悬液,移植200μL(约1.4×10~7个细胞)。于移植后24h、72h、120h处死各组大鼠,采集肝脏样本,进行苏木精-伊红(HE)染色,随后使用TUNEL染色分析细胞凋亡情况,最后使用q RT-PCR检测肝脏中白细胞介素-18(IL-18)、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:1.镜下观察h UCB-MSCs细胞均呈椭圆或长梭贴壁生长,细胞排列紧密,形态均一。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD90高表达,阳性率均>94%,CD34、CD45弱表达,阳性率<5.5%。与Control和NC-vector组相比,mi R-122在mi R-122-vector组表达显著升高。2.在转染后12h、24h、48h测得光密度值显示,mi R-122-vector组高于control组与NC-vector组(P<0.05)。检测PCNA表达,与Control和NC-vector组相比,PCNA在mi R-122-vector组中表达升高(P<0.05)。提示高表达mi R-122促进了h UCB-MSCs增殖。3.在向肝细胞诱导分化后,与相对应的对照组相比,转染mi R-122的h UCB-MSCs中AFP、ALB、CK-18、CK-19和CYP3A4的m RNA和蛋白水平升高(P<0.05)。其中,与不加分化诱导剂的Control组和NC-vector组相比,mi R-122-vector组中5种肝细胞标志物m RNA与蛋白表达水平均升高(P<0.05),与mi R-122-vector组相比,mi R-122-vector+Inducible factor组5种肝细胞标志物表达最高。4.D-gal和LPS联合攻击慢性肝损伤的大鼠模型后,对大鼠肝脏组织的HE染色观察到肝细胞出现灶状斑片状坏死,中央静脉汇管区可见炎性细胞浸润与纤维组织增生,病理症状随着时间增加而加重,表明ACLF大鼠模型建立。ACLF和ACLF+NC-MSCs组大鼠肝脏24h、72h、120h的HE染色显示,肝脏组织都出现不同程度的损伤,表现为肝细胞部分坏死,细胞水肿,炎性细胞浸润。与ACLF和ACLF+NC-MSCs组相比,ACLF+mi R-122-MSCs组HE染色显示肝细胞坏死明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,肝组织血管密度升高,新生毛细血管形成,肝脏纤维情况化得到改善,肝脏病理状态随着时间增加而逐渐好转。TUNEL染色显示在移植后24h、72h、120h时,ACLF+mi R-122-MSCs组肝细胞的凋亡率最低,ACLF组肝细胞凋亡率最高,ACLF+NC-MSCs组凋亡率介于其余两组之间,各组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。5.移植后24h,72h和120h时,三组中ACLF组Caspase-1与IL-18的m RNA表达均最高,VEGF的m RNA表达均最低,ACLF+mi R-122-MSCs组中Caspase-1与IL-18的m RNA表达均最低,VEGF的m RNA表达均最高,ACLF+NC-MSCs组中Caspase-1,IL-18和VEGF的m RNA表达水平介于其余两组之间,且各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.过表达mi R-122能够提高h UCB-MSCs增殖能力,并能够促进h UCB-MSCs向肝细胞分化;2.mi R-122修饰的h UCB-MSCs移植能够减轻ACLF大鼠肝脏病理的损伤程度,促进肝脏组织的修复,在ACLF大鼠模型中发挥一定保护作用。