人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV，或CMV)属β疱疹家族，在人群中感染非常普遍。正常人机体内，CMV处于一种潜伏的状态，但在免疫功能受损的患者(如器官移植、恶性肿瘤、AIDS病)体内，CMV可被激活，进而引起一系列的临床症状。目前，CMV在体内的活化或潜伏细胞尚不十分明确，有研究发现，CMV在体外可感染多种细胞，包括一些肿瘤细胞，而且CMV感染细胞后，可通过多种机制抑制细胞发生凋亡。 有报道血液系统肿瘤患者常发生CMV感染，而CMV活化更是血液系统肿瘤患者进行造血干细胞移植后常见的并发症，但CMV对肿瘤细胞或造血干细胞移植后的残余肿瘤细胞有何影响，尚不清楚。大量研究发现，多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者进行自体造血干细胞移植或CD34+分选的干／祖细胞移植后，极易发生CMV的感染。并且在自体造血干细胞移植患者中，MM患者较白血病及其它疾病的患者，CMV更易活化。另外，有报道MM患者在不进行移植的情况下就可发生CMV感染。可见，CMV感染与MM关系密切。MM是源于B细胞，以浆细胞恶性增生为特征的肿瘤，已经证实，其发病及进展主要与白介素6(interleukin 6，IL-6)为核心的细胞因子网络紊乱有关。IL-6及其受体系统的异常表达可导致骨髓瘤细胞的异常增生，也可明显地抑制细胞的凋亡。 有研究发现，CMV可激活细胞核因子κ B(nuclear factor kappa B，NF-κ B)，并可明显上调多种细胞IL-6的表达。但CMV在体外对MM细胞的作用如何?尚未见到报道。故本研究共分三部分内容：一、CMV能否感染MM细胞并在细胞内活化。二、以无血清培养诱导MM细胞发生凋亡，观察CMV能否抑制其凋亡的发生。三、初步探讨CMV引起细胞凋亡抑制的分子机制。 浙江大学博士学位论文 第一部分的研究中，将CMV AD169病毒株反复感染人胚成纤维细胞株HF细胞，发现随着病毒毒力的增加，细胞形态均由梭形逐渐膨胀、变粗、变圆，甚至从培养瓶壁上脱落下来。RT-PCR法发现cMv处理的HF细胞有CMv即刻早期抗原基因(I E) mRNA表达，流式细胞仪发现CMv处理的HF细胞有cMv pp65抗原表达。透射电镜下发现CMv处理的HF细胞内有大量CMv颗粒。以HF细胞及骨髓基质细胞为阳性对照，应用一定滴度(卜looTCIDS。)的CMV感染多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞、即Ml 8226细胞，按照上述三种方法检测CMV对细胞的感染及其在细胞内的活化。研究发现，1 TcIDS。的CMv处理的KM3细胞及即Ml8226细胞有较弱的IE mRNA条带，10、100 TCIDS。的CMv处理的细胞有较强的IE mRNA条带，而未经CMv处理的细胞无IE mRNA阳性条带;10、100 TCInsoCMV处理的KM3细胞，CMV pp65抗原阳性率分别为3.29%士0.92%、5.06%士1.90%，与未经eMV处理的KM3细胞(0.38%士0.40%)相比，差异有显著性(尸值分别为0.006、0.001)。相关性分析显示，eMv滴度与cMV pp65抗原阳性率呈显著正相关(r为0885，p<0.01)。同样，经100TCIDS。的cMv处理的RPMI 8226细胞中，4.3%的细胞有CMv pp65表达，而未经CMv处理的即Ml8226细胞内无CMv pp65的表达;透射电镜下，未经CMv处理的细胞内未见到病毒颗粒，而100TCIDS。的CMV处理的KM3细胞及即MI8226细胞内有CMV病毒颗粒。因此，本研究发现，CMV可明显感染MM细胞株KM3细胞及RPMI 8226细胞，并能在细胞内活化。 己经证实，骨髓基质细胞在体内是CMV的潜伏和活化细胞，体外研究也发现CMV可感染骨髓基质细胞，并在细胞内活化复制.我们的研究也从核酸水平、蛋白质水平，细胞超微结构等方面证实了这一点，同时发现CMV能使骨髓基质细胞的形态如人胚成纤维细胞一样发生改变，由梭形逐渐膨胀、变粗、变圆、甚至脱壁。提示，对造血干细胞移植的患者，不仅要关注CMV所引起的间质性肺炎，还应注意CMV感染骨髓基质细胞可能引起的造血紊乱。 大量研究发现，CMV感染细胞后可抑制多种细胞发生凋亡。为探讨CMV对MM细胞凋亡有无抑制作用，作者在第二部分应用CMV分别作用KM3细胞、RPMI 8226细胞后，无血清培养72h主动诱导细胞发生凋亡，观察CMV对其凋亡的影响.结果发现，100 TclDS。滴度 的CMV处理后，透射电镜下，CMV处理的KM3细胞及即Ml 8226细胞较少见到典型的凋 亡特征。而未经CMV处理的KM3细胞及RPMI 8226细胞中，大多出现典型的凋亡特征:胞 浆内出现空泡，同时核染色质固缩，核边聚，染色质断裂，凋亡小体形成等。进一步采用 AnnexinV-PI双标法流式细胞仪分析，结果发现，经1、10、100 TCIDs。滴度的CMV处理的浙江大学博士学位论文KM3细胞，无血清培养72h，早期凋亡加晚期凋亡细胞分别为48石7%士6.51%、42.00%士5.29%、26.33%士3.51%，其中经10、100 TcIDS。的CMv处理的KM3细胞，凋亡细胞明显少于未经CMV处理的无血清培养的KM3细胞(5733%士7.”%)，尸值分别为0.003，0.001，相关性分析显示，CMV滴度与凋亡细胞数呈显著负相关(r为一0.885，尸<0 .01)。对于即MI 8226细胞，1、10、100 TaDS。的CMV处理后，无血清培养72h，其早期凋亡加晚期凋亡细胞分别为53.2%、44.0%、21.2%，均少于未经CMV?