【摘 要】
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香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是通过破坏寄主维管束而致香蕉枯萎死亡的土传真菌病害。香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)存在寄主专化性和致病性分化。该病菌1号小种(Foc1)主要危害粉蕉(Musa AAB),4号小种(Foc4)几乎能危害所有香蕉种类,特别是目前主栽品种Cavendish(Musa AAA),造成了严重的经济损失。细胞自噬是真核生物
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香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是通过破坏寄主维管束而致香蕉枯萎死亡的土传真菌病害。香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)存在寄主专化性和致病性分化。该病菌1号小种(Foc1)主要危害粉蕉(Musa AAB),4号小种(Foc4)几乎能危害所有香蕉种类,特别是目前主栽品种Cavendish(Musa AAA),造成了严重的经济损失。细胞自噬是真核生物中广泛存在且保守的细胞物质循环过程,与植物病原真菌的营养平衡、细胞分化、次级代谢产物合成和致病性密切相关。本研究室前期研究发现,在降解寄主细胞壁多糖时,Foc4相较于Foc1差异表达的Atg基因数量较多,并且Foc4中有6个自噬相关基因(Au Topha Gy-related,Atg)特异上调表达,推测其可能与Foc4的致病性相关。但目前还未有Foc中Atg功能的相关研究。本论文通过基因克隆、基因敲除和致病性分析,首次对Foc4中自噬基因FocAtg6和FocAtg14的功能进行了研究。具体结果如下:(1)采用实时荧光定量PCR技术,对Foc4中6个Atg的表达水平与前期转录组研究结果进行验证分析。结果表明,在含1%葡萄糖的SM培养基诱导条件下,Foc4中6个自噬相关基因均上调表达,而在Foc1中无显著的差异表达。这6个基因分别为:comp13869_c0,comp19353_c0,comp20988_c0,comp21939_c0,comp 22041_c0,comp 22461_c0,其中comp13869_c0与comp19353_c0基因的上调表达水平最高,与预期的结果相符,因此推测comp13869_c0与comp19353_c0基因与Foc4的致病性相关。(2)对Foc1以及Foc4中6个自噬相关基因进行了克隆及序列分析,成功获得了2个小种6个自噬相关基因的DNA和c DNA序列信息,并且2个小种之间同一基因的序列同源性都在99%以上。通过进化树分析发现,6个自噬相关基因分别与多个物种的自噬基因具有较高的同源性。其中comp13869_c0与comp19353_c0分别与多个物种的自噬基因Atg6和Atg14具有较高的同源性,因此分别命名为FocAtg6和FocAtg14。(3)通过ATMT介导的基因敲除法,成功获得了基因敲除突变体Foc4-△FocAtg6与Foc4-△FocAtg14。表型分析结果表明:在PDA平板上Foc4-△FocAtg6的生长速率显著低于野生型Foc4,菌丝比较稠密,贴着培养基生长,并且在培养3 d后便生成大量色素,而Foc4-△FocAtg14的菌丝形态、生长速率与野生型Foc4并无明显差异;在含1%葡萄糖或果胶的SM培养基上,Foc4-△FocAtg6的生长速率也低于野生型Foc4,敲除突变体Foc4-△FocAtg6对单一碳源利用率下降。而Foc4-△FocAtg14的菌丝生长速率野生型Foc4并无明显区别;对产孢量及孢子萌发率进行统计分析发现,Foc4-△FocAtg6的产孢量显著低于野生型Foc4,孢子萌发迟缓,而Foc4-△FocAtg14的产孢量与野生型Foc4无明显差异。通过致病性分析发现,Foc4-△FocAtg6的致病力与野生型Foc4相比显著降低(P<0.01),说明FocAtg6是Foc4重要的致病相关基因,但Foc4-△FocAtg14的致病力与野生型Foc4无显著差异。本研究初步探讨了Foc4自噬基因FocAtg6和FocAtg14的致病功能,为2个小种的寄主专化性和致病性分化的分子机制提供了参考,为香蕉枯萎病杀菌剂提供了潜在的靶标位点。
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