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六价铬[Cr(Ⅵ)]是主要的重金属环境污染物之一,在人们的日常生活及工业生产中被广泛应用。Cr(Ⅵ)可通过呼吸、饮食和皮肤接触进入血液,对人体健康产生危害。研究表明长期暴露于重金属与心血管疾病发生有关,如何抑制重金属毒性、减轻其对人体的伤害有着重要的意义。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中,并具有较强的药用价值,能够改善血管通透性、降低血脂和胆固醇,从而发挥其心血管疾病的预防作用。花旗松素是一种天然黄酮类化合物,具有显著的抗氧化活性,可有效抑制氧化应激等因素导致的细胞损伤。然而,目前尚不清楚Cr(Ⅵ)诱发血管疾病的发病机制。本试验探讨Cr(Ⅵ)诱导人血管内皮细胞(HUVEC)和单核细胞型淋巴瘤细胞(THP-1)的损伤作用及花旗松素对其诱导细胞损伤的保护机理。与此同时,研究花旗松素在体内可能的转运机制,从而为探明Cr(Ⅵ)诱发血管疾病发生的机制和花旗松素在心血管疾病的预防与治疗中的应用提供一定的实验依据。首先,采用MTT法检测 10、20、40、60、80、100、150和200 μM下 Cr(Ⅵ)对HUVEC细胞生长的抑制情况;采用CCK-8法检测1、2、3、4、5、6和7μM下Cr(Ⅵ)对THP-1细胞生长的抑制情况;通过DCFH-DA荧光探针实验检测不同浓度的Cr(Ⅵ)对HUVEC细胞内氧化应激水平的影响;通过Hoechst 33258实验检测不同浓度的Cr(Ⅵ)对HUVEC细胞凋亡的影响;通过Real-Time PCR检测20 μM Cr(Ⅵ)对HUVEC细胞内相关炎症因子的mRNA转录水平的影响;通过Western blot方法检测Cr(Ⅵ)对HUVEC细胞p38 MAPK和JNK信号通路及线粒体内在凋亡信号通路的影响及对THP-1细胞NF-κB、p38MAPK和JNK信号通路的影响。试验结果表明,10μM和1μMCr(VI)可以显著抑制HUVEC和THP-1细胞增殖能力;10;10 Cr(VI)能够增强HUVEC细胞内氧化应激,诱导HUVEC细胞的凋亡,并存在一定的剂量-效应关系;20μMCr(Ⅵ)处理后HUVEC细胞内炎症小体调控基因NLRP3、粘附因子及白细胞介素家族中相关因子(IL-6和IL-1β)的表达上调,Cr(Ⅵ)可以激活HUVEC细胞内p38 MAPK和JNK信号通路,上调促凋亡蛋白Bax,同时抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达。同时,Cr(Ⅵ)能够激活THP-1细胞内NF-κB、p38 MAPK和JNK信号通路。其次,选取30和50 μM花旗松素预处理细胞,检测花旗松素对20 μM和1μM Cr(Ⅵ)诱导的HUVEC和THP-1细胞损伤介导的抑制作用。采用MTT和CCK-8法检测花旗松素对Cr(Ⅵ)诱导HUVEC细胞和THP-1细胞活力降低的保护作用;通过ROS荧光探针实验检测花旗松素抑制Cr(Ⅵ)诱导HUVEC细胞ROS产生的变化;采用Western blot方法检测花旗松素对HUVEC细胞内p38 MAPK、JNK、Nrf2和线粒体内在凋亡信号的影响及对THP-1细胞内p38 MAPK、JNK和NF-κB信号通路的影响。试验结果表明300μM花旗松素可以抑制Cr(Ⅵ)诱导的HUVEC和THP-1细胞活力降低,抑制Cr(Ⅵ)诱导HUVEC细胞ROS产生;Western blot检测结果表明花旗松素抑制HUVEC细胞内p38MAPK和JNK信号通路的激活,并可以通过激活Nrf2信号通路起到解毒作用。同时,花旗松素抑制Cr(Ⅵ)诱导THP-1细胞内MAPK、JNK和NF-κB信号通路的激活。最后,采用多光谱法和分子对接法探讨花旗松素与人血清白蛋白(HSA)的结合作用,从而探索花旗松素可能的体内运输机制。紫外光谱结果表明花旗松素可以改变HSA分子的二级结构;猝灭机制为静态猝灭;通过热力学公式计算,花旗松素与HSA相互作用力主要是氢键作用力;同步荧光光谱法结果表明花旗松素可以改变HSA中酪氨酸和色氨酸附近周围微环境的变化;分子对接结果表明花旗松素最有可能的结合位置是在HSA的I位点,被Ala 261、Ser 287、Leu 260、Ile290、Val293、Phe223、Ile264、Leu219、Leu238、Ala291、Tyr 150等氨基酸残基包围,并与HSA的Arg 257、His 242和Arg 222形成氢键。试验结果表明,Cr(Ⅵ)能够诱导HUVEC细胞损伤,激活p38MAPK和JNK信号通路,促使相关炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)及粘附因子的释放。同时,Cr(Ⅵ)能够诱导THP-1细胞损伤,激活NF-κB信号通路,使IL-1β释放到胞外。花旗松素可以抑制Cr(Ⅵ)对HUVEC细胞引起的氧化应激,并抑制粘附反应的发生。同时,花旗松素可以抑制Cr(Ⅵ)对THP-1细胞激活NF-κB信号通路,保护炎症反应的发生。以上结果表明,花旗松素对Cr(Ⅵ)诱导的两种不同类型细胞具有较好的保护作用,为Cr(Ⅵ)引起心血管疾病的发生及防治提供一定的理论及实验依据。