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全细胞生物转化因具有能耗低、催化效率高、专一性强、生产操作条件简单等优点,在科学研究和工业生产领域受到广泛关注。枯草芽孢杆菌因相较于大肠杆菌安全性高,更适用于食品及医药等领域的全细胞转化生产,但转化过程中普遍存在酶的表达量低、副反应导致底物或产物的降解、底物的跨膜通透速率影响转化效率等不足,增加了工业化成本。为此本文选取LGOX为报告蛋白,通过外源酶的筛选,结合内源谷氨酸代谢途径和转运系统研究枯草芽孢杆菌全细胞转化。主要内容和结果如下:1.两种不同来源LGOX的催化特性分析及功能验证将来源Streptomyces sp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶（LGOXstr）和Kitasatospora setae KM-6054的L-谷氨酸氧化酶（LGOXkit）在大肠杆菌E.coli BL21中实现异源表达获得重组LGOX,经HisTrapTMFF亲和层析柱纯化后LGOX比酶活分别为101.51 U×mg-1和45.98 U×mg-1。催化特性分析结果显示:重组LGOXstr和LGOXkit最适反应温度分别为50℃和40℃;最适反应pH分别为6.5和6.0;外源添加Mn2+能促进LGOX的酶活力;底物特异性显示两株重组LGOX底物专一性强,主要对L-谷氨酸起作用,其中LGOXstr对谷氨酰胺和天冬氨酸有微弱作用,LGOXkit对组氨酸和谷氨酰胺有微弱作用,对其它氨基酸无作用。2.重组枯草芽孢杆菌的诱导表达及全细胞转化初步验证构建了分别含Streptomyces sp.X-119-6和Kitasatospora setae KM-6054来源的LGOX木糖诱导型重组质粒pHYBSLGOXstr和pHYBSLGOXkit,分别转化至枯草芽孢杆菌WB600（B.subtilis WB600）中,获得重组菌WB602和WB603,经木糖诱导实现LGOX的胞内表达,重组菌WB602的LGOX酶活力相对较高。确定了最佳诱导条件:在接种发酵8 h时（生长对数中期）添加12 g×L-1的木糖诱导12 h,胞内酶活达最高0.57U×m L-1,20 g×L-1的全细胞催化剂催化40 g×L-1的谷氨酸生成25.8 g×L-1的α-KG。3.枯草芽孢杆菌内源谷氨酸代谢途径改造对全细胞转化系统的影响分别构建了缺失谷氨酰胺合酶基因glnA和淀粉酶基因amyE的突变菌WB605和WB609,将游离质粒pHYBSLGOXstr分别导入至上述重组菌中获得WB606和WB610。经全细胞转化10 g×L-1 L-谷氨酸结果显示,WB606的转化率达95.4%,比对照菌WB602的87.9%提高了8.5%,WB610的转化率提高至91.2%,仅实现LGOXstr基因整合表达的突变菌WB605和WB609的α-KG产量从原始菌的0.08 g×L-1提高到0.32 g×L-1。说明经代谢改造宿主的谷氨酸内源代谢途径——敲除glnA基因,能提高全细胞转化率。4.底物转运系统改造对全细胞转化系统的影响构建LGOXstr与谷氨酸转运蛋白GltP的共表达载体pHYBSLGOXstrGltP,转化至WB600中,获得重组菌WB611。经谷氨酸分析培养基测定重组菌WB602（对照）与WB611吸收胞外谷氨酸能力,结果显示谷氨酸的比消耗速率从对照菌的0.19 mmol×（h×g DCW）-1提高到0.24 mmol×（h×g DCW）-1,L-谷氨酸的比消耗速率提高了26.3%,初步验证了转运蛋白GltP的过表达能促进谷氨酸的吸收。收集经木糖诱导后的重组菌WB602（对照）与WB611经全细胞催化40 g×L-1谷氨酸,当两者反应达平衡时间时,平均转化速率从对照组1.55 g×L-1×h-1提高至1.89 g×L-1×h-1,提高了21.9%,说明谷氨酸转运蛋白GltP的过表达能提高全细胞催化速率。本文首先筛选获得了酶学性质优良的LGOX,接着分别从异源基因表达方式优化,细胞内源底物途经和细胞底物转运系统等方面对枯草芽孢杆菌全细胞转化系统进行遗传改造。所获得的全细胞转化宿主转化谷氨酸生成α-KG时转化率较改造前提高了8.5%,生物转化反应达平衡时的平均转化速率提高了21.9%。本研究为参与细胞内源代谢的全细胞转化系统的构建及改良提供了实验依据。