背景与目的肾小管上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是肾间质纤维化发生与进展的重要机制之一。有关研究表明，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达减少与肾间质纤维化程度密切相关，外源性VEGF可部分抑制TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞EMT。基础和临床实验研究结果均表明，人工重组红细胞生成素(rHuEPO)具有抑制肾间质纤维化、延缓慢性肾病进展的作用，但此种作用是否与肾小管上皮细胞EMT有关，目前尚未见报告。本研究之目的在于，探讨红细胞生成素(rHuEPO)对体外培养的近端肾小管上皮细胞EMT的作用及其与该细胞VEGF表达变化的关系。方法实验一，观察rHuEPO对EMT的抑制作用及其VEGF变化的关系：将体外培养的HKC细胞分为(1)阴性对照组：无血清培养细胞48h；(2)阳性对照组：TGF-β1(8ng／ml)处理细胞48h；(3)TGF-β1与rHuEPO共同处理组：不同浓度rHuEPO(0.1、1、10、50、100 IU／ml)和TGF-β1(8ng／ml)共同处理细胞48h；(4)rHuEPO单独处理组：不同浓度rHuEPO(1、10、50、100 Iu／ml)处理细胞48h；(5)rHuEPO预处理组：不同浓度rHuEPO(1、10、50、100 IU／ml)预处理细胞24h后，再加入TGF-β1(8ng／ml)作用24h。用间接免疫荧光方法检测各组细胞角蛋白的表达；用免疫组化双染方法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，E钙粘蛋白(E-cadherin)的表达。用半定量RT-PCR方法检测(1)、(2)、(3)组细胞α-SMA mRNA和VEGF mRNA的表达；用western blot方法检测(1)、(2)、(3)组细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，E钙粘蛋白(E-cadherin)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的蛋白表达。实验二，观察不同时间rHuEPO处理对EMT的作用及其VEGF变化的关系：将体外培养的HKC细胞分为(1)TGF-β1处理组：TGF-β1(8ng／ml)处理细胞72h；(2)rHuEPO预处理组：rHuEPO(100IU／ml)处理细胞24h后再加入TGF-β1(8ng／ml)再共同处理细胞72h，(3)rHuEPO同时处理组：rHuEPO(100IU／ml)与TGF-β1(8ng／ml)共同处理细胞72h，(4)rHuEPO滞后处理组：以时间效应分为4组，分别在TGF-β1(8ng／ml)处理细胞12h、24h、36h、48h后加入rHuEPO(100IU／ml)。用半定量RT-PCR方法检测各组HKC细胞α-SMA mRNA和VEGF mRNA的表达，用western blot方法检测HKC细胞α-SMA，E-cadherin，VEGF的蛋白表达。实验一、二均应用UVI凝胶成像分析系统进行扫描并记录光密度强度，蛋白表达强度以待测品光密度与β-actin光密度的比值表示，mRNA表达强度以待测品光密度与3-磷酸葡萄糖醛酸脱氢酶mRNA(GAPDH mRNA)光密度的比值表示。结果实验一(1)免疫荧光结果示：阴性对照组、rHuEPO单独作用组、rHuEPO(50、100IU／ml)和TGF-β1(8ng／ml)共同作用组及rHuEPO(50、100IU／ml)预处理组细胞角蛋白荧光表达为阳性。阳性对照组、rHuEPO(0.1、1、10IU／ml)和TGF-β1(8ng／ml)共同作用组及rHuEPO(1、10IU／ml)预处理组角蛋白荧光表达呈阴性。(2)免疫组化双染结果示：阴性对照组、rHuEPO单独作用组、rHuEPO(50、100IU／ml)和TGF-β1(8ng／ml)共同作用组及rHuEPO(50、100IU／ml)预处理组细胞E-cadherin表达阳性。阳性对照组、rHuEPO(0.1、1、10IU／ml)和TGF-β1(8ng／ml)共同作用组及rHuEPO(1、10IU／ml)预处理组细胞E-cadherin的表达明显减弱，多数细胞处于同时表达E-cadherin和α-SMA的中间状态。(3)阳性对照组α-SMAmRNA和α-SMA蛋白表达明显高于阴性对照组，E-cadherin蛋白表达明显低于阴性对照组，VEGFmRNA和VEGF蛋白表达明显低于阴性对照组(p＜0.01)。(4)rHuEPO(50，100IU／ml)与TGF-β1(8ng／ml)共同处理组α-SMA mRNA和α-SMA蛋白表达明显低于阳性对照组(p＜0.01)，高于阴性对照组(p＜0.01)；VEGF mRNA和VEGF蛋白表达明显高于阳性对照组(p＜0.01)，低于阴性对照组(p＜0.01)；E-cadherin蛋白水平明显高于阳性对照组(p＜0.01)，低于阴性对照组(p＜0.01)。实验二：(1)rHuEPO滞后处理组、rHuEPO预处理组和rHuEPO同时处理组α-SMA mRNA和α-SMA蛋白水平均明显低于TGF-β1处理组(p＜0.01)；rHuEPO滞后处理组、rHuEPO预处理组和rHuEPO同时处理组VEGF mRNA、VEGF和E-cadherin蛋白水平均明显高于TGF-β1处理组(p＜0.01)；rHuEPO预处理组和rHuEPO同时处理组与TGF-β1处理组之间差异最显著；rHuEPO预处理组和rHuEPO同时处理组之间无明显差异，与rHuEPO滞后处理组有明显差异(p＜0.01)。结论体外实验显示rHuEPO对TGF-β1诱导的肾小管上皮-间充质细胞转化具有一定抑制作用，该作用具浓度依赖性；提前或同时应用rHuEPO处理的作用优于滞后处理；rHuEPO稳定肾小管上皮细胞表型的作用可能与rHuEPO上调肾小管上皮细胞VEGF的表达有关。背景与目的肾小管上皮-间充质细胞转化(epithelia-mesenchymaltransition，EMT)是肾小管间质纤维化进展的重要机制之一。有关研究表明，MCP-1和TGFβ1参与间质纤维化的形成，并可诱导肾小管上皮细胞EMT；而VEGF的表达减少与肾间质纤维化程度密切相关，外源性VEGF可部分抑制TGFβ1诱导的体外培养的肾小管上皮细胞EMT。红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种在肾脏内生成的糖蛋白，若干实验研究与临床研究表明，rHuEPO具有减轻实验动物肾损伤和慢性肾病进展的作用，其作用可能与其抑制肾间质纤维化的作用有关。但rHuEPO延缓慢性肾病进展的作用是否与肾小管上皮-间充质细胞转化有关，目前尚未见报告。本研究之目的，在于探讨rHuEPO对单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠肾小管上皮-间充质细胞转化的作用，以及这种作用与肾组织MCP-1，TGF-β1，VEGF等细胞因子表达变化的关系。方法将60只雄性Wistar大鼠分为假手术组(n=20)，UUO组(n=20)及UUO+rHuEPO组(皮下注射rHuEP0100IU／kg，3次／周，n=20)，分别于手术后第3，7，14，21天处死动物留取血和肾组织标本。应用自动分析仪测定血肌酐和血红蛋白；Masson染色进行肾间质纤维化程度评分；用免疫组化方法测定。肾组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙粘蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血管形成抑制因子(TSP-1)的阳性细胞面积，双盲法应用CMIAS多功能真彩病理图像分析系统对免疫组化结果进行分析；western blot方法测定肾皮质α-SMA，E-cadherin，TGF-β1，MCP-1，VEGF蛋白的表达程度，用UVI凝胶成像分析系统进行扫描并记录光密度强度，蛋白表达强度以待测品光密度与β-actin光密度的比值表示。结果(1)血肌酐和血红蛋白水平：假手术组、UUO+rHuEPO组与UUO组各时间点血肌酐无显著差异(P＞0.05)；手术后第7、14、21天，UUO+rHuEPO组Hb水平明显高于UUO组和假手术组(p＜0.05)。(2)Masson染色显示随梗阻时间延长，UUO组肾间质纤维化程度逐渐加重；手术后第3、7天，UUO+rHuEPO组肾间质纤维化程度较UUO组明显减轻(p＜0.05)，第14、21天两组无显著差异。(4)UUO组α-SMA表达较假手术组明显增加，E-cadherin表达较假手术组明显减少(p＜0.05)：手术后第3、7天，UUO+rHuEPO组较UUO组α-SMA表达明显减少(p＜0.05)，E-cadherin表达明显增加(p＜0.05)；手术后第14、21天UUO+rHuEPO组与UUO组的α-SMA和E-cadherin表达无明显差异。(5)UUO组MCP-1、TGF-β1、TSP-1表达较假手术组明显增加，VEGF表达较假手术组明显减少(p＜0.05)；手术后第3，7，14天UUO+ rHuEPO组MCP-1、TGF-β1和TSP-1表达明显低于UUO组(p＜0.05)，而VEGF表达明显高于UUO组(p＜0.05)；手术后第21天，UUO+rHuEPO组与UUO组的MCP-1，TGF-β1，VEGF，TSP-1表达没有显著性差异(p＞0.05)。结论红细胞生成素(rHuEPO)可以减轻单侧输尿管梗阻模型大鼠早期肾间质纤维化程度和肾小管上皮-间充质细胞转化，该作用可能与rHuEPO下调肾问质MCP-1、TGF-β1、TSP-1表达，上调VEGF表达有关。背景与目的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是肾间质单核／巨噬细胞浸润的重要介质，MCP-1参与间质纤维化的形成，并非完全依赖其对单核／巨噬细胞的趋化作用。我们最近的研究表明，MCP-1也具有诱导肾小管上皮-间充质细胞转化(epithelia-mesenchymal transition，EMT)的作用。整合素连接激酶(ILK)已被证实是TGF-β1诱导EMT的关键效应分子，TGF-β1通过smad途径上调ILK的表达。目前，尚不清楚MCP-1与ILK在EMT过程中是否存在某种联系。本研究旨在探讨MCP-1诱导体外培养的肾小管上皮细胞转分化的影响和该细胞ILK表达变化的关系。方法将休外培养的HKC细胞分为：(1)阴性对照组：无血清培养细胞48h，(2)阳性对照组：TGF-β1(8ng／ml)处理细胞48h，(3)MCP-1处理组：不同浓度MCP-1(0.1，1.0，10，100ng／ml)处理细胞48h，并以MCP-1(1ng／ml)处理细胞在0h、12h、24h、36h、48h、72h各时间点观察。用半定量RT-PCR方法测定各组HKC细胞α-SMA mRNA表达，western blot方法测定各组HKC细胞α-SMA及ILK表达。在上述实验基础上进一步观察不同阻断剂作用下HKC细胞ILK表达的变化，包括PD98059(Mekl抑制剂10uM)，SB203580(p38 MAPK抑制剂5uM)和Y27632(ROCK抑制剂500nM)结果(1)MCP-1(0.1、1ng／mL)作用后HKC细胞α-SMA mRNA和α-SMA、ILK蛋白表达显著高于阴性对照组(p＜0.01)，但低于阳性对照组(p＜0.01)；其中以1ng／mL MCP-1组作用后α-SMA mRNA和α-SMA、ILK蛋白表达水平增高更为显著(p＜0.001)。(2)1ng／mL MCP-1组α-SMA mRNA和α-SMA、ILK蛋白表达在。至48h内逐渐增加，作用48h达到最高峰(p＜0.01)，72h时呈下降趋势；(3)分别加入阻断剂PD98059、SB203580和Y27632后HKC细胞ILK蛋白表达水平与MCP-1单独作用无显著差异(p＞0.05)。结论MCP-1可诱导肾小管上皮细胞转分化并呈时间浓度依赖性，该作用可能与MCP-1上调ILK的表达有关；MCP-1上调ILK的信号传导途径与Mekl、p38 MAPK、ROCK途径无关，有待于进一步研究。