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糖类物质与相应蛋白质之间的相互作用广泛存在于各种生物进程中,如细胞间的信息传递,细胞增殖和差异化以及肿瘤细胞的转移,免疫响应等。不仅如此,这些作用还与疾病的发生密切相关,如,细胞黏附是寄生虫、真菌、细菌以及病毒入侵宿主细胞的前提。我们发展了一种具有简单、低耗、高灵敏度、高通量等特性的微阵列生物芯片检测方法,用以考察糖类物质之间的相互作用。本论文研究工作主要内容包括以下几个方面:
1.发展了一种多糖微阵列芯片检测糖-蛋白相互作用:利用共价键将单糖或糖蛋白固定在芯片表面,与生物素修饰的凝集素进行识别反应,再用异硫氰酸荧光素(FITC)修饰的亲和素作桥连,并进行荧光检测,而后用生物素修饰的金纳米粒子(GNPs)标记反应,银增强后获得相应共振光散射(resonance light scattering,RLS)信号。通过比较发现以金纳米粒子为标记物的共振光散射光谱法比传统荧光标记检测法更灵敏,线性范围更宽。
2.发展了一种以金纳米粒子为标记物的抗体微阵列(三明治模式凝集素微阵列)芯片检测细菌的有效方法。应用这种抗体微阵列芯片选择性识别检测了不同种类的细菌(如革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌),检测限达到103个细菌,检测线性范围达到3个数量级。另外,抗菌药(阿莫西林和万古霉素)抑菌实验证明这种方法能有效检测抗菌药药效并获得相应的最低抑菌浓度(MIC)值。
3.发展了一种基于凝集素微阵列芯片的RLS检测法,用于识别检测细菌表面糖基。该方法通过固定于基片表面的凝集素捕获细菌,再用西非单叶豆凝集素Ⅱ(GSⅡ)修饰的金纳米粒子标记反应,银增强后获取RLS信号。应用这种凝集素微阵列芯片,考察了16种凝集素和5种细菌的相互作用,获得了凝集素与细菌的特异性识别图谱;并对不同生长环境中的细菌表面糖基变化进行检测。
4.应用上述凝集素微阵列芯片,进一步研究了金黄色葡萄球菌与3种抗菌药(阿莫西林,万古霉素和链霉素)间的相互作用。应用该方法对抗菌药的MIC值进行考察,并研究了抗菌药作用后细菌表面糖基表达的变化。