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目的:最常见的混合DNA出现于强奸案中,该混合DNA通常由精液(男性成分)和阴道液(女性成分)组成,目前可以采用多种方法来达到分离混合斑中男性成分和女性成分的目的。然而,在某些轮奸案现场会采集到两名甚至更多男性的混合精斑,或者在某些凶杀案现场中会采集到两名甚至更多个体的混合血迹或脱落上皮细胞的混合物等,这些混合DNA的个体识别问题,一直是混合DNA分析中的难题。从1998年至今,用于混合DNA分离的各类软件的出现使混合DNA分析在生物统计学方面得到了完善和发展,并为案件的侦破提供依据。然而,我国一直没有自主研发的针对混合DNA分离分析的相关软件,因此,对混合DNA分析软件的研发具有现实意义。本实验室前期已自主研发了一款用于混合DNA分析的sep DNA软件,目前该软件包含IDfiler(针对Life Technology公司的ID试剂盒检测)和Yfiler(针对Life Technology公司的Yfiler试剂盒)两个STR检测模块,软件的两个STR分型数学模型分别是Bayes和Iter,能够对两男和三男混合DNA进行STR基因型分离,通过对这两个数学模型的联合分析和综合考虑,从而推断出混合DNA的来源个体,并能够实现混合DNA各组分的个人识别“圈定”。因此,该研究课题主要针对本实验室自主研发的sep DNA软件,旨在对该软件已有试剂盒模块进行应用效能验证,并利用构建的混合DNA实验模型来增加其试剂盒模块,以拓展软件的检测应用范围。方法:1收集北京市局和山西省厅近年已破获的涉及混合DNA的DNA分型数据(包括混合STR分型及各混合DNA对应的已知来源个体的相关STR数据),通过对各案例的混合STR数据进行sep DNA软件分析,将软件分析结果与该混合DNA的已知来源个体的数据信息进行比较分析,对分析结果进行统计从而得到该软件对混合DNA分型的分离准确率,进而对该软件已有模块进行应用效能评估。2应用Pure Link?Genomic DNA Kit(美国Life Technologies公司)提取来自河北省血液中心的50名无关男子抗凝血样的全基因组DNA,按不同混合梯度构建两男和三男混合DNA模型,选用Amp F?STR?Identifiler?Plus Kit、Amp F?STR?Minifiler TM Kit和Goldeneye?DNA身份鉴定系统20A Kit共三个商品化试剂盒进行PCR扩增、电泳,对不同试剂盒STR检测系统针对两男和三男混合DNA模型的APH/APA、Mx、Hb、Ci等进行参数评估。通过将各混合DNA分型的sep DNA软件分离结果与各混合DNA对应的已知来源个体信息进行比较,采用Kruskal-Wallis H检验、Student-NewmanKeuls检验、配对四格表Mc Nemar检验、Pearson Chi-square检验、Dunnett’s检验等统计分析方法,分别对每个试剂盒进行sep DNA软件的应用效能评估,并将各试剂盒共有基因座挑选出来进行比较分析,以此来拓展软件的应用范围。结果:1应用效能评估部分:两个数学模型中Iter模型的整体分离准确率和各基因座分离准确率均低于Bayes模型,但将两种模型结合起来综合考虑后,分离准确率得到提高,在综合考虑备选基因型后效果更明显。结合收集的实际案例和构建的模型数据结果可以发现,综合考虑备选基因型后,分离准确率得到相应提高。将APH>1250rfu的样本挑选出来后发现,sep DNA软件的分离准确率明显提高。另外,基因座D16S539、D18D51、D2S1338、D7S820和FGA上drop-out发生率较高。2模块拓展部分:Identifiler Plus的混合DNA图谱中D值是随APH的降低而增大的,但在20A和Minifiler的混合图谱中观察到的数据并不完全符合这一规律。采用不同试剂盒构建的两男或三男混合DNA模型中峰高与峰面积均呈线性相关关系。Hb值在各基因座间及各混合比例间的差异绝大多数无统计学意义。总体上来看模型的基因座间均衡性都较好,其中Identifiler Plus和Minifiler试剂盒的Ci比20A更集中,带红色荧光的基因座Ci值偏低,带蓝色和绿色荧光的基因座Ci值偏高。针对Identifiler Plus试剂盒构建的两男混合DNA模型,若采用Bayes数学模型分析并考虑“备选基因型”,sep DNA软件分离准确率高达93.5%。总体来看,Identifiler Plus试剂盒的分离准确率最高,20A次之,Minifiler略低。其中,Minifiler试剂盒在CSF1PO基因座上的分离准确率高于Identifiler Plus试剂盒,在D2S1338基因座上的分离准确率高于20A试剂盒;20A试剂盒中D18S51基因座上针对三男混合DNA模型的分离准确率高于Identifiler Plus和Minifiler试剂盒。总体来看,Identifiler Plus试剂盒的分离准确率最高,20A次之,Minifiler略低。结论:1本软件可用于实际案例中混合DNA的分离。剔除发生drop-out的基因座后,对混合DNA的分离准确率达70%以上。若APH>1250rfu,综合考虑Bayes和Iter以及综合考虑最优和备选基因型时,分离准确率高达90%以上。2通过构建两男和三男混合DNA模型,在本软件中增加了ID Plus、Minifiler和20A三个试剂盒模块,拓展了其分析应用范围,使其能够更广泛地应用于法医物证混合DNA的分离。