中药复方PRD对OLETF大鼠视网膜自杀相关因子和半胱天冬酶-8表达的影响

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糖尿病(diabetes mellitus,DM)在眼部的主要并发症是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR),它作为一种不可逆盲,严重威胁患者的视功能。因DR发病机制复杂,目前尚未阐明。随着对DR研究的不断深入,人们认识到DR是一种神经血管性疾病,且神经组织的损伤可能早于微血管病理改变。研究发现细胞凋亡是参与DM视网膜神经组织损伤发病过程的重要事件。自杀相关因子(factors associated suicide,fas)和半胱天冬酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8,caspase-8)是细胞凋亡中死亡受体途径中重要的靶标因子,共同参与细胞凋亡。菩人丹(Purendan superfine powder,PRD)是以苦瓜为君药,丹参、人参为臣药,葛根、何首乌及水蛭为佐使药,六味药共同组成的中药复方。本研究旨在观察PRD对Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)大鼠视网膜fas和caspase-8表达的影响,为临床可能应用中药复方制剂PRD治疗DM视网膜神经组织损伤提供理论依据。目的:观察中药复方PRD对OLETF大鼠视网膜中fas和caspase-8表达的影响,探讨PRD对DM大鼠视网膜神经组织可能的保护作用。方法:1以雄性自发性2型DM大鼠模型OLETF大鼠和非DM对照组LETO大鼠为实验对象,以血糖峰值>16.7 mmol/L和负荷后120 min血糖>11.1mmol/L作为成模标准。造模成功后,将24只成模的OLETF大鼠随机分为PRD治疗组和DM模型组,每组各12只;同周龄12只雄性LETO大鼠为正常对照组。PRD治疗组大鼠连续PRD(1.8 g超微粉/kg/d)灌胃2个月,正常对照组和DM模型组给予等量蒸馏水灌胃。2苏木素-伊红染色观察各组大鼠视网膜的形态结构改变。3 TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠视网膜神经细胞的凋亡情况。4sp免疫组织化学染色法及免疫印迹法检测各组大鼠视网膜fas和caspase-8表达的蛋白。5逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)的方法检测各组大鼠视网膜中fas和caspase-8mrna的表达。结果:1各组大鼠视网膜组织的病理改变正常组:高倍光镜下可见视网膜各层结构完整、排列整齐,细胞大小均匀,内界膜完整。模型组:视网膜结构层次欠清楚,视网膜节细胞(retinalganglioncells,rgcs)排列紊乱,数量减少,有空泡样改变,并可见核固缩及部分核溶解,内界膜肿胀增厚、粗糙不平,可见部分内界膜破裂。prd组:视网膜的层次清楚,rgcs排列轻度紊乱,数量稍减少,内界膜表面肿胀增厚减轻,粗糙稍欠平。2tunel法检测视网膜细胞凋亡结果阳性产物表现为棕褐色、颗粒状,位于胞核中,在各组大鼠视网膜切片均可见。阳性细胞散在分布于内核层和rgcs层。与正常对照组相比,dm组大鼠视网膜神经细胞的ai显著升高(p<0.01);与dm组比较,prd治疗组视网膜神经细胞的ai明显降低(p<0.01)。3fas蛋白及mrna在各组大鼠视网膜的表达免疫组织化学显色结果显示,fas的阳性产物表现为棕黄色、细颗粒状,位于胞质中。免疫阳性细胞主要分布部位为内核层和rgcs层。与正常对照组相比,dm组大鼠视网膜fas蛋白及mrna表达显著升高(p<0.01);与dm组比较,prd治疗组大鼠视网膜fas蛋白及mrna表达显著降低(p<0.01)。4caspase-8蛋白及mrna在各组大鼠视网膜的表达免疫组织化学显色结果显示,caspase-8的阳性产物表现为棕黄色、细颗粒状,位于胞质中。免疫阳性细胞主要分布部位为内核层和rgcs层。与正常对照组相比,dm组大鼠的视网膜caspase-8蛋白及mrna显著升高(p<0.01);与dm组相比,prd治疗组大鼠的视网膜caspase-8蛋白及mrna显著降低(p<0.01)。结论:1prd可抑制fas、caspase-8蛋白及mrna在糖尿病视网膜组织中的表达。2 PRD对DR有保护作用,其机制可能是通过抑制fas及caspase-8蛋白及mRNA的表达,减少糖尿病视网膜神经细胞凋亡来实现的。
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