目前世界上近两亿名患者用胰岛素进行治疗(发展中国家患者的数量还在逐渐增加)，治疗上的进步使糖尿病患者寿命延长。胰岛素一般是从猪、牛胰中提取、由于其分子结构与人胰岛素存在差异，而且在动物内脏中胰蛋白酶比较活跃，因此胰岛素在提取时很容易被蛋白酶降解而失活，得率不高。随着糖尿病的发病率的升高，胰岛素制剂的需用量将相应增加，可能会引起供应的严重不足，这种情况促使人们产生了不以动物胰腺为原料，尽可能开发人胰岛素制剂的要求。基因工程合成人胰岛素则成为当今世界医药生产的首选。　　 本实验目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。以美国国家基因库(GenBank)发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板，参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体(pGEX-3x)的特点，设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段，为使表达纯化方便插入EcoRI及BamHI两个酶切位点，利用分步PCR步骤及重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术，休外延伸获得完整的人胰岛素原基因(Hins)。T-A克降后，筛选阳性克隆，提取质粒鉴定并测序。测序正确的人胰岛素原(Hins)基因插入E.coli高效表达载体pGEX-3X中进行了融合表达。实验结果如下：　　 (1)使用重叠延伸PCR(SOEPCR)技术，结合Klenow片段处理，体外延伸获得完整的具有大肠杆菌偏好的人胰岛素原基因Hins(B链-C肽-A链)。　　 (2)Hins基因片段通过粘性末端克隆到pMD19-T载体上。质粒鉴定测序结果，经过NCBIBlast对比，与AAP33446.1(homo sapiens insul in)的蛋白质序列的相似度为100％，与NM000207.2(homo insul in mRNA)核苷酸序列相似度为86％。　　 (3)成功构建pGEX-3X表达体系，通过IPTG诱导，表达出融合蛋白。蛋白电泳结果显示：含有空载体的大肠杆菌蛋白中，仪在26KD处有GST蛋白的表达，而含有Hins基因的融合蛋白在蛋白分子量32KD处有特异的蛋白质条带。　　 (4)优化表达体系：诱导时间6h、IPTG终浓度1.0mmol/L、培育温度30℃时，含有转化子的细胞表达量最高。　　 结论：在Taq DNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理，可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率。利用SOEPCR与Klenow片段预处理结合的方法，克隆出完整的具有大肠杆菌偏好的人胰岛素原基因Hins，并建立原核表达体系，成功在大肠杆菌中表达含人胰岛素原基因的融合蛋白。SDS-PAGE证明蛋白表达成功，为下一步研究人胰岛素原蛋白的生物学功能奠定了基础。我们通过分析融合蛋白诱导表达的时相，优化了诱导表达条件，使融合蛋白的表达水平得到提高。