论文部分内容阅读
为了研究病毒与宿主的相互作用,在传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleenand Kidney Necrosis Virus,ISKNV)感染鳜(Siniperca chuatsi)的抑制性消减cDNA文库基础上,经比对分析后发现,系统性RNAi缺陷相关基因1(Systemic RNAInterference Defective1,SID-1)和核帽结合蛋白2(Nuclear Cap-Binding Protein2,NCBP2)两个表达序列标签(Expression Sequence Tag,EST)在病毒抗性鳜鱼中表达上调。为探讨两者在宿主抵抗病毒感染中的作用,采用RACE技术调取了两条基因全长cDNA序列。
鳜SID-1 cDNA序列长3380 bp,编码855个氨基酸。氨基酸序列与其它脊椎动物SID-1相似性在70％以上,而与家蚕(Bombyx mori)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等相似性较低,在40％以下。预测分析显示,SID-1蛋白N末端310个氨基酸呈无规则卷曲位于细胞膜外侧,随后为9个复杂的跨膜结构域,C末端位于细胞内,其结构在亲缘关系近的生物中高度保守。荧光实时定量PCR分析表明,SID-1在鳜鱼体内广泛表达,其中以肌肉、血细胞中最高,其它免疫器官头肾、后肾、肝脏、脾脏及性腺中表达量也较高,而在心、脑、肠、皮及鳃中表达量较低。表达谱分析表明,ISKNV感染后,SID-1表达在血细胞、脾脏、鳃组织中呈现大致相同的规律,在感染后第3天上升到最高,随后表达水平逐步下降,第7天恢复到原有水平。而在头肾中则呈相反的表达规律,在感染后第7天到达高值,并在表现ISKNV抗性的鱼中表达量最高,这可能与鱼类头肾在免疫反应过程中的重要地位有关。在体外细胞进行的实验则呈现独特的规律,首先是在病毒感染后第1天小幅下降,随后随着感染天数的增加,其转录水平一直稳定增加,可能与体外条件下,缺乏生物体内复杂的调控机制有关。
亚细胞定位分析表明,SID-1主要在细胞膜,在细胞内部分区域呈点状聚集高表达。利用果蝇表达系统的分析表明,SID-1基因转染果蝇S2细胞后,可以高效的将dsRNA由培养液转运到细胞内,而空质粒转染组不具此能力。对FHM细胞的分析表明,FHM细胞本身即具备由培养液中摄取dsRNA的能力,但稳定表达SID-1基因后,其转运能力可提高5-9倍。利用G418筛选获得了稳定表达鳜SID-1基因的FHM细胞系,TFV感染实验显示,在培养液中添加TFV病毒ORF097基因的dsRNA条件下,稳定转染SID-1基因可将细胞病变时间推后3天；在不添加dsRNA条件下,也可将细胞病变时间推后2天。进一步荧光实时定量PCR、western blot及病毒滴度测定均显示,SID-1基因稳定表达细胞系病毒量均低于对照组,特别是在添加TFV病毒dsRNA的情况下,SID-1基因稳定表达细胞系病毒量远远低于对照组,在病毒感染后第2、3天对照组较实验组病毒量高100倍以上(1.36E+00/1.11E-02、2.19 E+00/1.45E-02)。利用SID-1基因原核表达抗原片段,制备了抗SID-1蛋白高效价的多克隆腹水(anti-SID),在鳜鱼Fry细胞进行的抗体阻断实验表明,在体外用抗体封闭SID-1蛋白的情况下,可提高ISKNV在细胞内的病毒量,则从另一方面验证了SID-1在宿主细胞抵抗病毒感染过程中的重要作用。
NCBP2基因全长1088 bp,编码164个氨基酸,具有一个RNA识别结构域(RRM),符合核帽结合蛋白特征。氨基酸比对分析表明,NCBP2蛋白在进化中较为保守,与所比对生物相似性均在70％以上。其基因组结构全长5093bp,包括5个外显子,4个内含子。亚细胞定位表明,NCBP2转染后在细胞内弥散性表达,但在细胞中央呈明显的集聚状表达。NCBP2基因转染FHM细胞后,通过G418筛选及单克隆化,建立了NCBP2稳定表达细胞系。TFV感染稳定表达NCBP2的FHM细胞后,通过观察细胞病变、TFV病毒荧光实时定量PCR以及western blot分析,均表明稳定表达NCBP2基因的细胞内TFV量明显降低(TFV感染后第1、2天实验组/对照组real time PCR定量:1.76E-05/1.79E-04、7.36E-04/1.56E-03),总体上可推迟细胞病变2天。