目的:本实验通过体外RNAi技术构建Cs基因功能下调的细胞模型,将携带有shRNA-Cs的质粒表达载体分别转染入内耳细胞HEI-OC1和293T细胞,旨在造成Cs基因的抑制,下调其表达水平,观察线粒体依赖性能量代谢、过氧化、内质网应激以及凋亡途径关键分子的表达与调控,研究增龄性聋相关基因Cs变化导致的相关信号通路中关键分子的变化及其在耳聋中发挥作用的具体机制,并且通过相关药物干预相关途径关键分子,观察对小鼠听力的保护作用。方法:本实验选取耳蜗HEI-OC1细胞和人293T细胞。(1)质粒表达载体的选择:通过定量PCR从购买的四种质粒表达载体中选择对Cs基因抑制效率高的作为研究对象;(2)ATP试剂盒检测实验组和对照组生成ATP含量的差别;(3)线粒体呼吸仪检测实验组与对照组氧耗速率及封闭槽内氧浓度的变化;(4)Western检测线粒体氧化应激、内质网应激及细胞凋亡途径关键分子(SOD2、UCP2、BIP、CHOP、Caspase-3)的表达的变化;(5)MitoSOX试剂盒检测实验组与对照组超氧阴离子产生的变化;(6)JC-1试剂盒检测实验组与对照组线粒体膜电位的变化;(7)小鼠出生后7天开始补充α-硫辛酸,然后分别于3、4、6、8周检测补充α-硫辛酸的A/J小鼠(实验组)及未补充α-硫辛酸的A/J小鼠(对照组)的听觉诱发脑干电位(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)的变化趋势。结果:Cs knockdown组和对照组(转染空载体)相比发现,Cs knockdown组的细胞ATP生成含量下降,线粒体氧耗速率也降低,提示线粒体能量代谢受到一定损伤,超氧阴离子生成增多,线粒体超氧化物歧化酶(SOD2)的mRNA和蛋白表达水平升高说明CS降低可引起细胞超氧化物生成增多,并启动了抗氧化作用,内质网应激关键分子(BIP、CHOP)蛋白含量均升高,说明CS分泌不足可以激活内质网应激,Cs knockdown组线粒体膜电位降低、线粒体解偶联蛋白(UCP2)水平降低和Caspase-3蛋白含量升高,提示凋亡的产生。结论:Cs基因突变导致CS合成减少,从而引起能量生成减少、超氧化物产生增加、内质网应激及细胞凋亡的产生;给予A/J小鼠补充抗氧化剂(α-硫辛酸)对听力有一定保护作用。