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展青霉素（patulin,PAT）,又称棒曲霉素,是一种有毒的真菌次生代谢产物,能产生PAT的真菌有扩张青霉、展青霉等共有3属16种。目前,PAT主要污染水果及其衍生产品,例如苹果、山楂等。毒理学研究表明,PAT有急、慢性毒性、遗传毒性、细胞毒性、致癌性和免疫毒性等特性。到目前为止,PAT的毒性机制尚未完全探究清楚,目前研究主要侧重在PAT对HEK293肾脏细胞,HepG2肝癌细胞,HCT116结肠癌细胞等细胞系,缺少PAT对肝原代细胞的研究。本研究以体外分离培养的小鼠肝原代细胞和体内小鼠肝脏组织为研究对象,研究PAT对小鼠肝原代细胞以及肝脏组织凋亡影响,并进一步探讨其可能的机制。本研究第一步旨在提取并验证小鼠肝原代细胞并测定PAT干预小鼠肝原代细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),进一步检测PAT对小鼠肝原细胞的凋亡影响。首先,我们采用改良后的两步胶原酶灌流法提取小鼠肝原代细胞,同时采用糖原染色和免疫组织化学染色对其进行相关验证,证实所提取的细胞确实为小鼠肝原代实质细胞;接着,运用CCK-8法检测PAT处理小鼠肝原代细胞的IC50值,以选取后续进行实验的PAT浓度;选取几种不同浓度的PAT干预小鼠肝原代细胞48h,通过Annexin V-FITC/PI双染法检测PAT对小鼠肝原代细胞早期凋亡的影响,结果发现凋亡率明显上升;随后检测了凋亡蛋白家族Caspase的蛋白表达水平和活性水平,结果表明PAT能增强Caspase 3和Caspase 9的蛋白水平的表达并能显著提高Caspase 3的活性,说明Caspase 3和Caspase 9蛋白参与了其凋亡的过程。以上结果证实PAT能促进小鼠肝原代细胞早期凋亡且内源性的线粒体凋亡途径参与了其凋亡发生。本研究第二步旨在探讨PAT促进小鼠肝原代细胞凋亡的潜在机制。我们首先选取不同浓度的PAT处理小鼠肝原代细胞48h,通过CCK-8法检测PAT对小鼠肝原代细胞存活率的影响,结果显示PAT能显著降低小鼠肝原代细胞的存活率;随后检测不同浓度的PAT处理后细胞内活性氧自由基（Reactive Oxygen Species,ROS）的水平变化,结果显示胞内ROS明显升高,并呈剂量效应;接着进一步检测了胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量变化,实验结果显示PAT处理降低小鼠肝原代细胞内GSH的含量,引起ROS在细胞内蓄积,说明ROS可能参与了其凋亡过程的发生。线粒体作为细胞的能量工厂,既是ROS的重要来源,又是可能的促凋亡靶点,为探讨PAT处理小鼠肝原代细胞后ROS升高是否会损伤线粒体,我们检测了线粒体跨膜电位Δψm及ATP水平,发现两者均明显下降,表明PAT处理的确会导致线粒体损伤。此外,我们通过彗星实验和ELISA法检测不同浓度PAT干预对小鼠肝原代细胞DNA的影响,结果发现小鼠肝原代细胞DNA链损伤及上清中8-OHdG含量升高,证实PAT处理后会导致细胞DNA损伤。为了证实ROS升高是否是PAT导致细胞凋亡的直接因素,我们将小鼠肝原代细胞经过外源性的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）和Mito-tempo预先处理1h后给予PAT刺激,发现经过NAC和Mito-tempo预处理后小鼠肝原代细胞内ROS产生减少,细胞存活率上升、细胞凋亡率下降、Caspase 3激活减少,进一步研究发现线粒体损伤、DNA损伤都有所恢复。以上结果提示PAT可通过增强小鼠肝原代细胞的ROS水平,损伤胞内的氧化/抗氧化系统,继而损伤线粒体和胞内DNA,激活线粒体/Caspase 9凋亡途径诱导细胞凋亡发生。本研究第三步旨在探讨PAT在体内对小鼠肝脏组织的凋亡影响和肝毒性研究。我们首先监测小鼠持续灌胃PAT 4周时间后肝脏酶指标,发现ALT、AST均升高;并观察小鼠肝脏组织的病理学改变,结果显示PAT处理后小鼠肝脏的病理切片出现肝细胞肿胀明显,细胞质疏松呈空泡状;通过TUNEL法测量小鼠肝脏组织内凋亡情况,发现经过PAT处理的小鼠肝脏组织凋亡程度较高;进一步检测小鼠肝脏组织内效应分子Caspase 3的蛋白表达情况,结果显示经过PAT处理的小鼠肝脏组织Caspase 3蛋白表达升高明显。以上结果表明,在体内,PAT处理可促进小鼠肝脏细胞的凋亡,造成肝损伤。